一种在聚集态下具有活体细胞显影功能的强双光子吸收三苯胺衍生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在聚集状态下具有强双光子吸收性能的有机材料及其制备方法， 具体地说是一种在聚集状态下具有低毒性、活体细胞显影功能的三苯胺基强双光子吸收材 料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着双光子吸收材料的迅速发展和荧光共聚焦显微镜的商品化应用，双 光子荧光成像技术在应用方面有了重大突破。由于双光子跃迀具有很高的空间分辨率和选 择激发性，所以在生物成像中具有显著的优点：双光子吸收采用红外或近红外波段的激光 作为激发光源，能大大降低生物组织对激发光的吸收，避免组织自发荧光的干扰，获得较强 的样品荧光；同时，由于双光子技术使用的是长波激发，具有激发能量低、波长长、穿透性 强、光损伤小等特点，因此双光子技术在生物分子探测、医疗诊断和荧光显微成像技术等领 域中有巨大应用潜力和广阔应用前景。
[0003] 聚集诱导发光(AIE)是克服荧光分子在高浓度下应用瓶颈的重要手段，特别是对 双光子吸收分子，具有AIE效应的双光子分子能有效避免高浓度诱导的荧光淬灭，使之更适 合于生物体内的显微成像，因此，开发具有AIE效应的有机双光子吸收材料成为一个新的研 究热点（D.Ding，K.Li，B.Liu，B.Z.Tang.Accounts of chemical research,2013,46( 11): 2441-2453.)
[0004] 三苯胺衍生物具有可变的浆型结构、较强的给电子能力以及易于结构修饰等优 点，一直是光功能材料的重要构筑基元。（G.Keke，Z.Jian，C.Jiule，D.Ming.Optical review，2013，20(5): 385-389.)。同时三苯胺衍生物易于构建成枝状分子，而枝状分子在聚 集诱导发光和双光子吸收材料中具有广泛的应用前景。因此，近年来，人们对于具有双光子 活性的三苯胺衍生物在聚集态下作为双光子敏化材料表现出了极大的兴趣。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种在聚集态下具有活体细胞显影功能的枝状三苯胺衍生物双 光子吸收材料及其制备方法。
[0006] 本发明通过筛选合适的具有双光子吸收性质的有机材料构筑基元，与三苯胺缩合 成具有不同枝数的有机小分子，通过枝数的调整来优化材料的聚集诱导发光性能和双光子 吸收性能，并使其具备低毒性和在聚集态下具有强双光子显影功能，从而适于活体细胞生 物显影。
[0007] 本发明三苯胺衍生物的通式如（I)所示：
[0008
[0009] 通式（I)中，经R4、R5、R6组合形式如下产物：
[0010] T1)R4 = H，R5 = H，R6=X;或
[0011] T2)R4 = H，R5=X，R6=X;或
[0012] T3)R4=X，R5=X，R6=X;
[0013] 所述 T1)、T2)、T3)中
[0014] 一种在聚集态下具有活体细胞显影功能的强双光子吸收三苯胺衍生物的制备方 法，其特点在于，按以下步骤进行：
[0015] a、将DMF、三氯氧磷和三苯胺混合，升温至40-60°C反应lh，得到中间体I;
[0016] b、将DMF、三氯氧磷和三苯胺混合，升温至90-110°C反应10-24h，得到中间体Π 和 中间体m;
[0017] c、将中间体I、对硝基苯乙腈和无水乙醇混合，加热溶解，再加入催化剂哌啶，升温 至60-80°C反应2h，冷却，抽滤，醇洗后干燥得到目标产物T1;
[0018] d、将中间体Π 、对硝基苯乙腈和无水乙醇混合，加热溶解，再加入催化剂哌啶，升 温至60-80°C反应2h，冷却，抽滤，醇洗后干燥得到目标产物T2;
[0019] e、将中间体m、对硝基苯乙腈和无水乙醇混合，加热溶解，再加入催化剂哌啶，升 温至60-80°C反应24h，冷却，抽滤，醇洗后干燥得到目标产物T3。
[0020] 作为优选，所述步骤a的具体步骤为：
[0021 ]冰浴条件下，向反应容器中加入DMF，磁力搅拌下缓慢滴加三氯氧磷，继续搅拌至 形成白色浆状物后升温至50-60°C，加入三苯胺，反应lh后溶液变成深红色，然后将反应液 倒入大量冰水中，并用饱和Na 2C03水溶液调节pH值至8.0，得到大量黄色沉淀，抽滤得淡黄色 粗产物，经柱层析得中间体I。
[0022]进一步，所述步骤a中DMF、三氯氧磷和三苯胺的摩尔用量为8:10:1。
[0023]作为优选，所述步骤b的具体步骤为：
[0024]冰浴条件下，向反应容器中加入三苯胺、N，N_二甲基甲酰胺，磁力搅拌下缓慢滴加 三氯氧磷，直至容器底部形成淡黄色固体，90-1HTC下回流12h;反应结束后将黑色油状液 体倒入冰水中，不断搅拌下饱和Na 2C03水溶液调至pH=8.0，有黑色沉淀出现，将沉淀减压抽 滤，滤液用90mL CH2C12分三次萃取，将沉淀用上述CH2C12萃取液溶解，加入200-300目硅胶， 浓缩至干，经柱层析分别得中间体Π 和中间体m。
[0025] 进一步，所述步骤b中三苯胺、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔用量为1:10 : 10。
[0026] 作为优选，所述步骤c的具体步骤为：
[0027]将中间体I，对硝基苯乙腈溶于无水乙醇，加热使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流2h，停止反应，冷却至室温，有大量红色沉淀析出，抽滤、滤出物用乙醇洗涤数次， 真空干燥得红色产物T1。
[0028]进一步，所述步骤c的中间体I和对硝基苯乙腈的摩尔用量为1:1.2。
[0029] 作为优选，所述步骤d的具体步骤为：
[0030] 将中间体Π ，对硝基苯乙腈溶于无水乙醇，加热使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流12h，停止反应，冷却至室温，有大量红色沉淀析出，抽滤、滤出物用乙醇洗涤数次， 真空干燥得红色产物T2。
[0031] 进一步，所述步骤d的中间体Π 和对硝基苯乙腈的摩尔用量为1:2.4。
[0032] 作为优选，所述步骤e的具体步骤为：
[0033] 将中间体m，对硝基苯乙腈溶于无水乙醇，加热使之完全溶解，然后加入哌啶，60-80°C回流24h，停止反应，冷却至室温，有大量红色沉淀析出，抽滤、滤出物用乙醇洗涤数次， 真空干燥得红色产物T3。
[0034]进一步，所述步骤e的中间体ΙΠ 和对硝基苯乙腈的摩尔用量为1:3.6。
[0035]本发明以具有强供电子能力的三苯胺和强吸电子能力的对硝基苯乙腈为构筑基 元，利用Vilsmeier反应合成具有不同枝数的三苯胺衍生物作为聚集态下的双光子显影材 料，简洁高效地制备了具有较高荧光量子产率的有机小分子双光子显影材料，并测得其具 有较低的生物毒性和活体组织细胞双光子荧光显影的特性。
[0036]经实验发现，本发明制备的三苯胺衍生物T1-T3在聚集态下分别在780nm、800nm和 800nm处双光子吸收截面(σ)最大，双光子吸收能力最强。HepG2细胞被目标产物染色后，可 清晰地观察到该系列有机分子对ifepG2细胞细胞质具有高的识别能力。
[0037]与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0038] 1、本发明合成的有机小分子双光子吸收材料T1-T3是一类在聚集态下具有细胞显 影功能的双光子吸收材料。与其它材料相比在高浓度条件下或水溶性环境中出现聚集后具 有较大的双光子吸收截面，激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对 细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值；
[0039] 2、HepG2细胞被目标产物染色后，可清晰地观察到该系列双光子材料对细胞质具 有尚的识别能力；
[0040] 3、本发明原料易得，成本低，合成步骤简单，产率高，易于操作。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明的制备路线图。
[0042]图2(a)是本发明有机双光子吸收材料T1的扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)。 [0043]图2(b)是本发明有机双光子吸收材料T2的扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)。
[0044] 图2 (c)是本发明有机双光子吸收材料T3的扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)。
[0045] 图3(a)为本发明有机双光子吸收材料T1的双光子吸收图（激发能量为36mW)。
[0046] 图3(b)为本发明有机双光子吸收材料T2的双光子吸收图（激发能量为36mW)。
[0047] 图3(c)为本发明有机双光子吸收材料T3的双光子吸收图（激发能量为36mW)。
[0048] 图4是有机双光子吸收材料T1-T3对HepG2细胞荧光共聚焦显微成像:al_a3为目标 产物着色的HepG2细胞的单光子荧光共聚焦显微照片;bl-b3为明场作用图；cl-c3为目标产 物着色的IfepG2细胞的双光子荧光共聚焦显微照片;dl-d3为叠合的照片。
[0049] 以下结合附图通过【具体实施方式】对本发明技术方案做进一步解释说明。本部分对 本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。本领域技术人员清楚，在 下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。
【具体实施方式】
[0050] 本发明以二苯胺为起始原料，先制备中间体I N，N_二苯基_4_甲酰基苯胺，中 间体Π --N，N-二(4-甲酰基苯基)苯胺和中间体ΙΠ --N，N-二(4-甲酰基苯基)-4-甲酰基 苯胺，再由中间体I，Π 和m分别与对硝基苯乙腈合成目标化合物T1 一一(Z)-3-(4-二苯氨 基)苯基_2_(4_硝基)苯基丙稀臆，T2 4，4' -双(2_ (4_硝基)苯基丙稀臆)_3_叉-二苯胺 和T3-一4,4'，4"_三(2-(4-硝基)苯基丙烯腈)-3-叉-三苯胺。具步骤如下：
[0051 ] 1、中间体I的制备：
[0052] 冰浴条件下，在100m