一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物的提取纯化领域，具体涉及一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法。 技术背景
[0002] 洛伐他汀(Lovastatin)是微生物的一种代谢产物，被证实具有强烈抑制胆固醇合 成的作用，属他汀类药物，其高效、低廉的特性使其成为临床上治疗高胆固醇、高血脂症状 的首选药物。其化学名称为[lS-[lα(R*)，3α，7β，8β(2S*，4S*)，8αβ]]-l，2,3,7,8,8α-六氢-3,7-二甲基-8-[2-(四氢-4-羟基-6氧代-二氢吡喃-2)-乙基]-1-奈基-2-甲基丁酸酯，有两 种结构形态，分别为酸型和内酯型，在强碱条件下几乎以开环酸型存在，在酸性条件下两种 形态都有，它们可以相互转化，化学结构式如下：
η刖，土广拍ΤΛι???Ν/^τ术州twi谀土物土安书二人夭：工m每、5丄m每仲百每，食人g⑴ 生产洛伐他汀所选用的微生物最多是土曲霉，因其产量较高。红曲霉也是产洛伐他汀的一 大菌种，虽然产量较土曲霉低，但是，红曲在我国已有1000多年历史，是古代食疗两用的中 药材，因其安全、低毒的特性，红曲霉来源的洛伐他汀越来越受到消费者的喜爱。
[0003] 红曲霉(Monascus)是一种小型丝状腐生真菌，大多数菌株在PDA培养基上长势良 好，最初颜色较浅，随时间延长颜色呈红色或浅红色，菌落呈绒毡状或皮膜状，因种而异。洛 伐他汀为红曲菌的次级代谢产物，研究表明，液态发酵洛伐他汀产量可达〇. 59g/L，固态发 酵产量可达6.3g/kg。因此，红曲菌可作为洛伐他汀药物的生产菌株。近年来高血脂及相关 的心血管疾病已成为影响人类身体健康的主要疾病之一，我国有8000万人血脂偏高，引起 这些疾病的主要原因就是体内合成过多胆固醇，而洛伐他汀是抑制胆固醇合成最受欢迎的 药物，其应用潜力巨大。
[0004] 目前，洛伐他汀的分离纯化工艺主要采用萃取、结晶、重结晶的方法，这种方法存 在两大问题： 一是该方法较适用于以土曲霉为生产菌的洛伐他汀分离，而红曲菌的代谢产物中除洛 伐他汀外还含有大量的红曲色素，色素与洛伐他汀可溶性相似，难以萃取分离，也难以结晶 除去。
[0005] 二是洛伐他汀一般要经过多次重结晶才能达到纯化要求，而且每次精制采用溶剂 体系不同，过程复杂，并且使收率降低，成本升高。
[0006] 为了解决以上工艺问题，本发明采用柱层析技术分离红曲洛伐他汀。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种红曲洛伐他汀的纯化制备方 法。通过采用硅胶柱和Sephadex LH20柱层析分离，选用不同极性有机溶剂进行梯度洗脱， 达到了非常好的纯化效果(纯度可达95%)，解决现有工艺复杂、收率低、成本高的问题。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案： 红曲洛伐他汀的纯化制备方法，包括以下步骤： 1) 取红曲霉液态发酵液，用6 mol/L的氢氧化钠调pHIO~12,室温下120~180 r/min振 荡1~3 h，4000~4500 r/min离心5~10 min，取上清液； 2) 硅胶柱层析:取适量步骤1)的上清液上样，上样后先加1~1.5倍柱体积乙酸乙酯溶剂 进行洗脱，再加1.5~1.8倍柱体积的混合溶剂1(乙酸乙酯：甲醇=2:l，v/v)洗脱，最后加 0.8~1倍柱体积的混合溶剂2(乙酸乙酯：甲醇=3:1，v/v)洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒； 收集洗脱液用旋转蒸发器55 °O60°C蒸干，加水溶解，得溶解液； 3) LH20柱层析:取步骤2)的溶解液适量上样，上样后，先加1~1.1倍柱体积超纯水进行 洗脱，再加1~1.5倍柱体积20% (v/v)甲醇洗脱，最后加1~1.2倍柱体积50%(v/v)甲醇洗 脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒;收集20%( v/v)甲醇洗脱液，用旋转蒸发器55°〇60°C蒸干， 加水溶解，得到纯化的洛伐他汀溶液。
[0009] 硅胶柱的制备方法为：将80~120目的硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子径高 比为1:15~1:20,硅胶体积总量为上样量的20~25倍，得到硅胶柱。
[0010] LH20柱的制备方法为：取Sephadex LH20(羟丙基葡聚糖凝胶）用60%乙醇溶液(v/ v)浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20，LH20的体积总量为上样量的8~10倍，得到 LH20 柱。
[0011]本发明的有益效果在于： 1) 发酵液处理简单，仅需两次过柱，效率高，周期短，降低成本;得到的洛伐他汀杂质 少，纯度高，可达95%; 2) 本发明避免使用毒性较大的溶剂，分离效率明显提高，解决了工艺复杂、成本高的问 题，适于工业化生产。
【附图说明】
[0012]图1为紫色红曲霉液态发酵液中洛伐他汀粗品的HPLC图谱； 图2为紫色红曲霉液态发酵液中洛伐他汀纯化后HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0013] 本发明采用下列实施例来进一步说明，但本发明的保护范围并不限于下列实施 例。
[0014] 实施例1 红曲霉发酵液中洛伐他汀的分离纯化方法： (1)将紫色红曲霉发酵液离心去除菌体，取上清液分装在250 mL锥形瓶中，装液量200 mL，用6 mol/L的氢氧化钠调pH为11，在室温下、180 r/min振荡1 h，取出后4200 r/min离 心5 min，取上清液;经检测，上清中洛伐他汀含量在350~400mg/L; (2)取120目硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子直径为9mm，装柱高度约12~13cm，得 到硅胶柱;取〇.5mL步骤（1)中的上清液上样，上样后，先加15 mL乙酸乙酯进行洗脱，再加20 mL混合溶剂1(乙酸乙酯：甲醇=2:1，v/v)洗脱，最后加8mL混合溶剂2(乙酸乙酯：甲醇=3:1， v/V)洗脱，控制流速在1滴/秒。收集洗脱液； (3 )取(2 )中的洗脱液20mL用旋转蒸发器55 °〇60 °C蒸干，加 lmL水溶解，得溶解液； (4) 取Sephadex LH20用60%(v/v)乙醇浸泡后湿法装柱，柱子直径为9mm，装柱高度约4~ 5 cm，得到LH20柱;取步骤(3)中溶解液0.5 mL上样，上样后，先加5 mL超纯水进行洗脱，再 加5 mL 20%(v/v)甲醇洗脱，最后加5 mL 50%(v/v)甲醇洗脱，控制流速在1滴/秒;收集5 mL 20%( v/v)甲醇洗脱液，得收集液； (5) 取步骤(4)中的收集液10 mL用旋转蒸发器60 °C蒸干，加1 mL水溶解，得到纯化的 洛伐他汀溶解液。
[0015]洛伐他汀纯度测定--HPLC检测法 色谱柱：HITACHI LaChromUltra C18 (5 μπι); 流动相：乙腈:0 · 01 wt%磷酸=60:40(v/v); 检测波长：238 nm; 进样量：10 UL; 流速：1 mL/min; 柱温:28 °C; 经HPLC检测，洛伐他汀纯度为95%，收率为45%。
【主权项】
1. 一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 取红曲霉液态发酵液，调pH为10~12,室温下120~180 r/min振荡1~3 h，4000~4500 r/min离心5~10 min，取上清液； 2) 硅胶柱层析:取步骤1)上清液上样，上样后先加1~1.5倍硅胶柱体积的乙酸乙酯进行 洗脱，再加1.5~1.8倍硅胶柱体积的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂1洗脱，最后加0.8~1倍硅 胶柱体积的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂2洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒;收集洗脱液，用 旋转蒸发器55 °O60°C蒸干，加水溶解，得溶解液； 3. Sephadex LH20柱层析:取步骤2)的溶解液上样，上样后，先加1~1.1倍LH20柱体积的 超纯水进行洗脱，再加1~1.5倍LH20柱体积的20%(v/v)甲醇溶液洗脱，最后加1~1.2倍 LH20柱体积的50%(v/v)甲醇溶液洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒;收集20%(v/v)甲醇洗 脱液，用旋转蒸发器，55 °〇60 °C蒸干，加水溶解，得到纯化的洛伐他汀溶液。2. 根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：步骤1)中采用 6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH。3. 根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于:步骤2)的硅胶柱 的制备方法为:将80~120目的硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20， 硅胶体积总量为上样量的20~25倍，得到硅胶柱。4. 根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于:步骤2)中所述的 乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂1中，乙酸乙酯：甲醇=2: l(v/v);所述的乙酸乙酯和甲醇的混合 溶剂2中，乙酸乙酯：甲醇=3:1 (v/v)。5. 根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于:步骤3)中LH20柱 的制备方法为:取Sephadex LH20用60%(v/v)乙醇溶液浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15 ~1:20，LH20的体积总量为上样量的8~10倍，得到LH20柱。
【专利摘要】本发明属于药物的提取纯化领域，具体涉及一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法。先采用硅胶柱对红曲霉液态发酵液的上清液进行分离，依次选用乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇按体积比2:1混合的溶剂、乙酸乙酯和甲醇按体积比3:1混合的溶剂进行梯度洗脱，得溶解液；然后再采用LH20柱对溶解液进行分离，依次选用超纯水、20%（v/v）甲醇溶液、50%（v/v）甲醇溶液进行梯度洗脱，得到纯化的洛伐他汀溶液。本发明避免使用毒性较大的溶剂，分离效率明显提高（纯度可达95%），解决了工艺复杂、成本高的问题，适于工业化生产。
【IPC分类】C07D309/30
【公开号】CN105566268
【申请号】CN201610130764
【发明人】林娟, 李亮, 许鑫琦, 叶秀云
【申请人】福州大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月9日