一种用于标记羧酸类化合物的荧光衍生试剂的合成及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及衍生试剂技术领域，具体涉及一种用于标记羧酸类化合物的荧光衍生试剂的合成及应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酸广泛地分布于自然界中，是生物体内重要的营养物质和代谢产物。对调节生物体内生理和生物功能起着重要作用。饱和脂肪酸通常被认为对人体有害，如果食用过量，能引起高胆固醇症和心血管疾病。然而许多研究也证明饱和脂肪酸对酒精引起的肝损伤有治疗作用。因此脂肪酸的定量分析在生物学和药学领域都有重要意义。
[0003]由于这类化合物在紫外-可见光区吸收较弱，光度法难以准确测定。目前较常用的方法是GC法，但GC法在分析前需进行酯化处理，操作繁琐且检测限低。高效液相色谱荧光检测法具有较高的灵敏度，用于柱前衍生的试剂主要有溴代香豆素类化合物和重氮甲烷类，然而该类化合物对潮气及水不稳定。NOEPES磺酸酯也可用于脂肪酸类化合物的衍生测定，但衍生过程需在氢氧化钾、冠醚以及相转移催化剂的存在下于苯或甲苯溶剂中完成，分离前也需烦琐的预处理，费时、费力。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种衍生产率高、条件温和、操作简便，衍生溶液不必预处理可直接进样分析的荧光衍生试剂的合成及应用，能够解决上述问题。
[0005]本发明解决上述问题所采用的技术方案是:
[0006]—种用于标记羧酸类化合物的荧光衍生试剂的合成，包括以下步骤:
[0007]1)2-噻吩-2-1!1-菲[9，10-(1]并咪唑的合成，在100011^三口烧瓶中，分别加入1689，10-菲醌、12mL 2-噻吩甲醛、120g醋酸铵和300mL冰醋酸，在机械搅拌的条件下快速加热至Ij80-90°C，保持温度搅拌反应3h。反应物冷却至室温后倒入烧杯中，用氨水调节pH至7-8，过滤，固体用水洗2次后放暗处干燥。干燥后的固体用乙腈/DMF(5:1，v/v)重结晶三次，得棕色晶体，产率88 %。
[0008]2)2-(2-噻吩-2-基-菲[9，10-d]并咪唑-1-基)-乙醇的合成，在500mL烧瓶中，分别加入9g 2-噻吩-2-1H-菲[9，10-d]并咪唑，痕量氢氧化钾和lOOmLDMF，在搅拌的条件下加热到沸腾后，把3.2g的碳酸亚乙酯分三次在Ih内加入到烧瓶中，在继续加热5h。反应完毕冷却到室温后，烧瓶中的混合物倒入到300mL水中，过滤并用水和60 %乙醇依次洗涤固体。固体干燥后用乙腈/DMF(4:1，v/v)重结晶三次，得黄色晶体，产率51%。
[0009]3)2-(2-噻吩-2-基-菲[9，ΙΟ-d]并咪唑-1-基)-对甲苯磺酸乙酯(TSTPE)的合成，在10mL烧瓶中，分别加入3g对甲基苯磺酰氯和20mL吡啶，冷却至0°C。把6g 2-(2-噻吩-2-基-菲[9，IΟ-d]并咪唑-1-基)_乙醇溶解在1mL吡啶中滴加到烧瓶中的溶液里，保持溶液在0°C搅拌反应4h，继续在室温下搅拌反应1h后，反应物倒入适量冰水中并搅拌0.5h。过滤，固体用水洗涤，干燥后用乙腈重结晶3次，得浅黄色晶体，产率91%。
[0010]—种用于标记羧酸类化合物的荧光衍生试剂的应用，将荧光衍生试剂用于标记脂肪酸类化合物，浓度为1.0X 10—Vol.L—1的混合脂肪酸(C5-C30)标准溶液用乙腈/DMF(1:l，v/v)溶解;准确称取0.5gTSTPE，用DMF溶解并定容至10mL，得浓度为1.0X10—V)l.L—1的荧光衍生试剂溶液；向盛有1mg无水K2CO3的2mL安培瓶中依次加入400yL DMF，10yL混合脂肪酸标准溶液，220yL荧光衍生试剂溶液，封口后于85°C恒温水浴下振荡反应30min，得到稳定的荧光产物。
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]本发明合成了新型高灵敏的荧光试剂2-(2-噻吩-2-基-菲[9，ΙΟ-d]并咪唑-1-基)-对甲苯磺酸乙酯(TSTPE)，在DMF溶剂中以碳酸钾为催化剂，85°C时反应30minS卩可获得稳定的荧光产物，衍生产率高、条件温和、操作简便，衍生溶液不必预处理可直接进样分析。
[0013]实验数据:
[0014]溶液的制备，浓度为1.0X10-4mol.L_1的混合脂肪酸(C5-C30)标准溶液用乙腈/DMF(1:1，V/V)溶解。准确称取0.5gTSTPE，用DMF溶解并定容至10mL，得浓度为l.0XlO-Smol.L-1的衍生试剂溶液。所有的溶液保存于4°C的冰箱中。
[0015]样品中脂肪酸的提取，称取样品约0.2g，放于1mL容量瓶中用1mL氯仿浸泡，超声振荡数次放置过夜后过滤。残余物加入2mL氯仿洗涤，滤液合并后加1.5mL吡啶超声振荡20秒使其转变为相应脂肪酸的有机盐，溶剂经N2吹干分别用600yL DMF定容备用。
[0016]脂肪酸的衍生，向盛有1mg无水K2⑶3的2mL安培瓶中依次加入400yL DMF,10yL混合脂肪酸标准溶液，220yL衍生试剂溶液，封口后于85°C恒温水浴下振荡反应30min，放冷后取10yL衍生液加入280yL乙腈/DMF溶液(1:1，v/v)稀释后直接进样1yL分析。
[0017]色谱条件，色谱柱为HypersiIBDS-C8coIumn(200 X4.6mm,5ym);流动相A为5% 乙腈，B为乙腈，梯度洗脱条件:t = 0min时为60%B，t = 15min时为80%B，t = 40min时为100%B，并保持100%B运行15min;流速为l.0mL.π?η-1;柱温为30°C;激发波长为260nm，发射波长为380nm。
[0018]脂肪酸标准品衍生物的色谱分离，按前述优化条件，对26种脂肪酸标准溶液衍生后的色谱分离结果见图2，所有衍生物在50min内获得良好的基线分离。
[0019]线性关系和检测限，26种脂肪酸衍生物在10pmol到40fmol的范围内呈现良好的线性关系，且相关系数大于0.993线性方程见图3，按照信噪比(S/N = 3)计算所有衍生物的检出限在8.8-45.5fmol之间。
[0020]衍生试剂和衍生溶液的稳定性，TSTPE溶液保存于4°C冰箱中，在两周内重复进样分析，峰面积没有明显变化，见图4，表明TSTPE足够稳定。衍生溶液保存于4°C冰箱中，在一周内平行进样测定6次，计算峰面积的标准偏差〈2.5%，表明衍生产物足够稳定。
[0021]重现性，在前述条件下，对25pmol脂肪酸衍生物进行平行六次分析，保留时间和峰面积重现性见图5，保留时间相对标准偏差RSD( % )小于0.18%，峰面