基于nbdk的定点荧光标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于NBDK的定点荧光标记方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质荧光标记是一种用于研究蛋白质结构和功能的重要手段。目前已有的荧光 标记技术大致包括以下几种：（1)荧光蛋白广泛应用于蛋白质的标记，例如红色荧光蛋白 Green Fluorescent Protein(GFP)是一种通过融合表达进行蛋白质标记方法，然而焚光蛋 白只能通过融合表达的方法标记在蛋白质的氮(N)端或碳(C)端，无法在蛋白质氨基酸其他 序列中实现标记;且由于GFP体积较大，会对蛋白质结构和功能造成影响，其应用范围有限。 鉴于荧光蛋白质在蛋白质标记上的缺点，近年来基因编码NBDK和NBD-酪氨酸的技术得以发 展，利用NBD-酪氨酸或NBDK的定点插入，可克服荧光蛋白的缺点。然而这两种氨基酸只能用 488nm的激发光进行激发，发射波长在510-550nm的绿光，相比荧光蛋白标记方法，荧光氨基 酸发射的荧光尚单一，急需扩展。NBDK可被560nm的激发光激发，在600-640纳米发射，弥补 了NBDK类氨基酸的无法在偏红外波长发射荧光的不足。吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶可以 在细菌和真核细胞中实现穿梭，广泛应用于识别非天然氨基酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合 成酶的筛选。
[0003] 基于此，有必要设计一种基于NBDK的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动 物细胞)中实现目的蛋白的红色荧光标记。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于NBDK的定点荧光标记方法，所述基于NBDK的定点 荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞）中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位 点的荧光标记，旨在解决目前荧光标记方法无法实现真核生物蛋白的红色荧光标记。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种基于NBDK的定点荧光标记方法，所述基于NBDK 的定点荧光标记方法包括如下步骤：
[0006] 51:获得183冰64?711?突变库；
[0007] S2:获得 NBDK;
[0008] S3:筛选特异识别NBDK的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(NBDKRS)突变体(NBDKRS);
[0009] S4:在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入NBDK，验证筛选得到的NBDKRS能够实 现目的蛋白质在偏红外荧光标记插入。
[0010]优选地，所述步骤S1包括如下步骤：
[0011] 511:人工合成18&吐64?711?的0嫩序列；
[0012] S12:将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒 A；
[0013 ] S13:设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物、引物引物f-260NNk和引物 r-L260NNk、引物f-L270NNK和引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK、 引物f-W382NNK和引物 r-W382NNK;
[0014] S14:以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-260NNk和引物r-L260NNk为引物，通 过聚合酶链式反应，获得突变库1;
[0015] S15:以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNk和引物r-L270NNk为引物，通过 聚合酶链式反应，获得突变库2;
[0016] S16:以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为 引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3;
[0017] S17:以所述突变库3为模板，以所述引物f-W382NNk和引物r-W382NNk为引物，通过 聚合酶链式反应，获得突变库4;
[0018] S18 :所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照预定的比例混合，获得用于 NBDK筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。
[0019]优选地，所述预定的比例为1:1:32:1。
[0020] 优选地，所述步骤S2包括如下步骤：
[0021] S21:取预设量的4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑(NBD-C1)和赖氨酸，溶于乙酸乙 酯和水中，并加热到30°C，滴加预设量的十六烷基三甲基溴化胺，反应2小时后即可得到 NBDK1；
[0022] S22:取预设量的NBDK1经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到NBDK2。
[0023] 优选地，所述NBDK2经过0.22微米滤膜过滤除菌，获得NBDK母液C。
[0024] 优选地，所述NBDK母液C的浓度设定为1 OOmM。
[0025] 优选地，所述步骤S3包括如下步骤：
[0026] S31:构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；
[0027] S32:构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选，获得能够特异识别 NBDK的氨酰-tRNA合成酶NBDKRS的菌株。
[0028] 优选地，所述 NBDKRS 的突变位点为 L260G，L270A，N311A，N313G，W382C。
[0029] 优选地，所述S4包括如下步骤：
[0030] S41:共转化 NBDKRS-pBK 和 Myoglobin-4tag-pBAD 至 T0P10 中；
[0031 ] S42:获得纯化的Myoglobin蛋白质；
[0032] S43:将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在550nm激光激发下，发出焚光，即可验证 筛选得到的NBDKRS能够实现目的蛋白的红色荧光标记。
[0033]本发明提供的基于NBDK的定点荧光标记方法通过合成M. Barker i物种的吡咯赖氨 酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上;通过采用"饱 和突变"的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸 氨酰-tRNA合成酶突变库Lib-NBDKRS;通过合成用于定点荧光标记的NBDK，进行筛选和验 证，达到了基于NBDK在真核生物(哺乳动物细胞）中实现目的蛋白的红色荧光标记。
【附图说明】
[0034]图1为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的流程示意图；
[0035]图2为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的步骤S1的流程示意图；
[0036]图3为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的步骤S2的流程示意图；
[0037]图4为本发明NBDK的结构示意图；
[0038]图5为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的步骤S3的流程示意图；
[0039]图6为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的步骤S4的流程示意图。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解 释，本发明并不局限于以下实施例。
[0041] 本发明提供的基于NBDK的定点荧光标记方法，所述基于NBDK的定点荧光标记方法 是通过检测真核生物鲸鱼肌红蛋白插入了 NBDK，所述鲸鱼肌红蛋白在560nm激光激发下，发 出荧光来实现的。
[0042] 在本实施例中，M.Barkeri表不一种产甲烧厌氧菌；PylRS(pyrrolysine aminoacyl-tRNA synthetase)中文为吡略赖氨酸氨酰-tRNA合成酶。
[0043] 在实施例中，如图1所示，图1为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的流程示意 图。野生型产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶）只识别吡咯赖氨酸(第22 种基因编码的天然氨基酸），并催化吡咯赖氨酸和对应的tRNA发生转运反应，从而把吡咯赖 氨酸连接到对应tRNA上，延伸因子EF-Tu携带上述产物至核糖体，参与蛋白质合成。tRNA又 称转运RNA(transfer ribonucleic acid tRNA)，是具有携带并转运氨基酸功能的一类小 分子核糖核酸。但是野生型的产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)并不识 别NBDK，NBDK的中文全称为7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-赖氨酸；因此并不能确定哪一种 PylRS突变体能够识别NBDK，所以要做突变-建库-筛选(定向进化），最终筛选到能够特异识 别NBDK的PylRS突变体，即命名为NBDKRS。
[0044]在本实施例中，如图2所示，图2为本发明基于NBDK的定点荧光标记方法的步骤S1 的流程示意图。步骤S1为获得M.Barkeri PylRS突变库;在实现步骤S1的过程中，又可分8个 步骤来实现：
[0045] 511:人工合成]\1.1^冰61^?711?3的0嫩序列；
[0046] S12:将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A;
[0047] S13:设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物、引物引物f_260NNk和引物 r-L260NNk、引物f-L270NNK和引物