一种与叶绿素合成相关的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种与叶绿素合成相关的蛋白及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 光合作用是地球上最大规模利用太阳能的过程，它为几乎所有的生命活动提供有 机物、能量和氧气。每年地球上通过光合作用合成的有机物约为2200亿吨，相当于人类每 年所需能耗的10倍。植物干物质的90% -95%来自光合作用的产物，光合作用是作物产量 形成的物质基础。光合作用主要在植物叶片的叶绿体中进行，需要一系列的色素和蛋白复 合体的参与。叶绿素是吸收光能的主要色素，叶绿素的减少或缺失将使叶片颜色变浅，直接 影响光合作用的效率和功能。随着植物分子生物学和生物化学的发展，人们分离克隆了催 化叶绿素合成的各种酶及其基因。然而，叶绿素的合成受到体内和环境因子的调节，这种调 节作用又是受核基因和（或）质体基因的控制，因此，叶绿素的合成和降解存在复杂的调控 网络。分离和克隆关键或重要的调控因子，对揭示叶绿素的代谢，通过人工改造提高光能利 用效率及抵抗生物和非生物胁迫具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种与叶绿素合成相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0004] 本发明所提供的蛋白质，来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana)，名称为ALAD，是 如下（a)或（b):
[0005] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006] (b)将（a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与叶绿素合成相关的蛋白质。
[0007] 为了便于所述蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋 白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0008] 表：标签的序列
[0009]
[0010]
[0011] 上述（b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0012] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0013] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0014] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因（ALAD基 因）；所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0015] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0017] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0018] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0019] 其中，序列2由1293个核苷酸组成，整个序列2即为0RF，编码序列表中序列1所 示的PP01蛋白。序列1由430个氨基酸组成。
[0020] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0021] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0022] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加 工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使 用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、 组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛素基因 Ubiquitin 启动子（pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境 筛选转化植株。
[0023] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组 成。
[0024] 所述蛋白质，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下中的 应用也属于本发明的保护范围：
[0025] (a 1)调控植物抗病性；
[0026] (a2)调控植物生长；
[0027] (a3)调控植物体叶绿素合成。
[0028] 在本发明中，所述调控植物抗病性体现在：在所述植物体内，所述蛋白质的表达量 越低，所述植物的抗病性越强；所述蛋白质的表达量越高，所述植物的抗病性越弱。
[0029] 在本发明中，所述调控植物生长体现在：在所述植物体内，所述蛋白质的表达量越 低，所述植物的生长越受抑制；所述蛋白质的表达量越高，所述植物的生长越受促进。
[0030] 在本发明中，所述叶绿素的合成的能力体现在植株叶片中叶绿素合成途径的中间 产物PBG的含量上，所述叶绿素合成能力降低具体体现为植株叶片中叶绿素合成途径的中 间产物PBG的含量降低，所述叶绿素合成能力提高具体体现为植株叶片中叶绿素合成途径 的中间产物PBG的含量提高。
[0031] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0032] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0033] a)在目的植物中对所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
[0034] b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下性状中至少 一种的转基因植物：
[0035] (bl)抗病性增强；
[0036] (b2)植株生长受到抑制；
[0037] (b3)叶绿素合成能力降低。
[0038] 所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量低于所述目的植物；编码所述蛋白质的 基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0039] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0040] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0041] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0042] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0043] 步骤a)中，在所述目的植物中对所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将 序列表中序列3所示DNA片段导入所述目的植物中实现的。
[0044] 其中，序列3由702个核苷酸组成。
[0045] 进一步，所述序列表中序列3所示的DNA片段，是通过重组表达载体的形式转入所 述目的植物中的。
[0046] 更为具体的，所述重组表达载体为在PDS1301载体的酶切位点（如Κρη I和Spe I)之间插入了序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒。
[0047] 所述重组表达载体具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物 细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0048] 本发明的还一个目的是提供另一培育转基因植物的方法。
[0049] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0050] c)向目的植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植 物；
[0051] d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下性状中至少 一种的转基因植物：
[0052] (dl)抗病性降低；
[0053] (d2)植株生长受到促进；
[0054] (d3)叶绿素合成能力提高。
[0055] 在上述应用或方法中，所述抗病性体现为对病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000的抗性。所述叶绿素的合成能力体现在植株叶片中叶绿素合成途径 的中间产物PBG的含量上，所述叶绿素合成能力降低具体体现为植株叶片中叶绿素合成途 径的中间产物PBG的含量降低，所述叶绿素合成能力提高具体体现为植株叶片中叶绿素合 成途径的中间产物PBG的含量提高。所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0056] 在本发明的一个实施例中，所述植物为拟南芥，具体为野生型拟南芥（No-Ο生态 型）。
[0057] 本发明的还一个目的是提供一种D