一种与植物衰老相关的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种与植物衰老相关的蛋白及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 衰老是植物生长周期中一个必然的环节，它可以发生在细胞、组织、器官或有机体 水平。叶片衰老是发生在器官水平的衰老。叶片衰老的产生是受植物发育时期控制的，但 同时又受到多种内在信号和外在环境因素的影响。各种内在和外在因素共同影响植物叶片 产生衰老过程，是植物适应环境的一种保护机制。例如在干旱、饥饿、氧化胁迫及病原菌侵 染的不利环境中，植物叶片会出现提前衰老，从而促使植物提前完成生活史，来应对不利的 环境。在农业生产中，适度的叶片衰老有利于收获，例如，棉花叶片在后期衰老脱离，可以大 大节省劳动力，防止棉花中混杂叶片，有利于机械化收获。
[0003] 人们对植物衰老机理的认识还非常有限，分离克隆调控衰老的重要基因，一方面 可以加深对衰老机制的研究，另一方面，研究成果对农业生产有潜在的应有价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与植物衰老相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 本发明所提供的蛋白质，来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana)，名称为VQ25,是 如下（a)或（b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)将（a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与植物衰老相关的蛋白质。
[0008] 为了便于所述蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋 白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0009] 表：标签的序列
[0010]
[0011] 上述（b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0012] 在本发明的一个实施例中，所述蛋白质具体为将序列表中序列2的第1-525位插 入到PCAMBIA1302载体的酶切位点Nco I和Spe I之间后表达得到的蛋白质。
[0013] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0014] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0015] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因（VQ25基 因）；所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0016] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0018] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0019] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0020] 其中，序列2由528个核苷酸组成，整个序列2即为0RF，编码序列表中序列1所示 的蛋白质。序列1由175个氨基酸组成。
[0021] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0022] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 ?81121、？8丨1119、？041^142301、？041^141301-1]1^~或其它衍生植物表达载体。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加 工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使 用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、 组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛素基因 Ubiquitin 启动子（pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与 编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结 构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性 的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境 筛选转化植株。
[0024] 在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为 35S启动子（如CaMV 35S启动子）。
[0025] 更为具体的，所述重组表达载体为在PCAMBIA1302载体的酶切位点中插入所述基 因后得到的重组质粒。所述酶切位点具体为Nco I和Spe I。
[0026] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组 成。
[0027] 所述蛋白质，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在调控植物 衰老中的应用也属于本发明的保护范围。
[0028] 在本发明中，所述调控植物衰老体现在：在所述植物体内，所述蛋白质的表达量越 高，所述植物衰老时间越提前；所述蛋白质的表达量越低，所述植物衰老时间越延迟。
[0029] 本发明的另一个目的是提供一种培育早衰转基因植物的方法。
[0030] 本发明所提供的培育早衰转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0031] a)向目的植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植 物；
[0032] b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老提前的转基因植 物。
[0033] 在该方法中，所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物。
[0034] 在该方法中，所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物 中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞 或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0035] 本发明的还一个目的是提供一种培育晚衰转基因植物的方法。
[0036] 本发明所提供的培育晚衰转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
[0037] c)在目的植物中所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
[0038] d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，衰老推迟的转基因植 物。
[0039] 在该方法中，所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量低于所述目的植物。
[0040] 在以上两个方法中，编码所述蛋白质的基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分 子：
[0041] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0042] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0043] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。
[0044] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0045] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0046] 在本发明的一个实施例中，所述植物为拟南芥，具体为野生型拟南芥（Col生态 型）。
[0047] 在本发明中，所述衰老具体体现为植株生活史周期缩短和/或叶片的衰老。
[0048] 本发明的还一个目的是提供扩增所述基因全长或其任意片段的引物对。
[0049] 实验证明，本发明的所提供的VQ25基因能够促进植物早衰，帮助植物提前完成生 活史，在农作物育种中，通过遗传改良过量表达VQ25,有望实现在农业生产上提前收获农作 物的目的。
【附图说明】
[0050] 图1为VQ25过量表达转基因植株（10号和12号株系）与野生型拟南芥（Col生 态型）的VQ25基因表达量分析结果。
[0051] 图2为VQ25过量表达转基因植株（10号和12号株系）与野生型拟南芥（Col生 态型）的衰老表型比较结果。#10即表示10号转基因株系；#12即表示12号转基因株系。
[0052] 图3为VQ25基因在不同叶龄组织中的表达量分析。
【具体实施方式】
[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 野生型拟南芥（Col生态型）：购自美国拟南芥种质资源中心（网址：http:// abrc. osu. edu/)。记载于"曾后清等.拟南芥体内硝酸盐积累差异与细胞膜H+_ATPase的 关系·南京农业大学学报，2011，34(6) : 89-94" 一文。
[0056] pCAMBIA1302 载体：记载于 "Hajdukiewicz et al. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol, 25 (6)，989-994 (1994) " 一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。
[0057] 农杆菌（Agrobacte