用于检测氟苯尼考的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别氟苯尼考的单 克隆抗体，以及用于检测氟苯尼考的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
【背景技术】
[0002] 氟苯尼考属于氯霉素类化合物，主要用于治疗动物呼吸道和肠道感染。氟苯尼考 有一定的胚胎毒性，中国、美国、日本及欧盟等许多国家和组织都规定了其在动物组织中的 最大残留限量。目前仪器分析的方法虽然能够达到对氟苯尼考的检测要求，但是仪器昂贵、 样品前处理繁琐、对操作人员要求也很高。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术 具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，与仪器检测方法相 比，ELISA方法更具优势。
[0003] 酶联免疫吸附法是以抗原抗体的特异性反应原理进行检测的生物技术，由于它是 一种简单、灵敏度高、特异性好的检测方法，因此得到了广泛的应用。目前国内外已有关于 氟苯尼考抗体制备方法的报道:Luo(2009)建立了检测猪肉中的氟苯尼考和氟苯尼考胺的 残留方法，以氟苯尼考胺为半抗原，采用甲醛偶联法进行免疫原合成，得到了一株可以识别 氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗体。孙法良等(2009)建立了鸡肉当中氟苯尼考的残留检 测方法，以氟苯尼考琥珀酸酐为半抗原，通过琥珀酸酐法合成免疫原，得到了一株多克隆抗 体，对氟苯尼考IC 5Q为79.3yg/L。冯才茂等（2012)以氟苯尼考胺为半抗原，采用碳二亚胺法 合成完全抗原，制备的多克隆抗体最低检测限为〇. 5yg/L，对氟苯尼考交叉反应率为150%。 朱爱荣等(2015)以氟苯尼考胺为半抗原，通过戊二醛法合成抗原，最终获得了能够识别氟 苯尼考的多克隆抗体。沈建忠等(2008)申请了一种检测氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法及其 专用酶联免疫试剂盒的专利，以氟苯尼考胺为半抗原，通过EDC方法合成免疫原，最终获得 了能够同时识别氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗体。深圳市绿诗源生物科技有限公司于 2009年申请了一种氟苯尼考类药物快速检测试剂盒的专利，其中以氟苯尼考琥珀酸酐作为 半抗原，通过混合酸酐法合成免疫原，通过免疫小鼠或者新西兰大白兔从而获得能够识别 氟苯尼考的单克隆抗体或者多克隆抗体。由上可见，目前文献报道的多为多克隆抗体，多克 隆抗体虽然灵敏度较高，但是批间变异大，没有单克隆抗体性质稳定。另外，现有的单克隆 或多克隆抗体识别的专属性和灵敏度较低，无法特异性地识别氟苯尼考，且识别的1(： 50过 尚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的为：
[0005] (1)提供一种能特异性识别氟苯尼考的单克隆抗体；
[0006] (2)提供所述单克隆抗体在制备检测氟苯尼考药物残留的酶联免疫试剂盒中的应 用；
[0007] (3)提供一种含有所述单克隆抗体的酶联免疫试剂盒；
[0008] (4)提供所述酶联免疫试剂盒在氟苯尼考药物残留非诊断目的检测中的应用；
[0009] (5)利用该单克隆抗体，建立一种氟苯尼考药物残留非诊断目的检测的ELISA方 法；
[0010] ⑻提供一种所述的ELISA方法在氟苯尼考药物残留非诊断目的检测中的应用。
[0011]上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0012] -种能识别氟苯尼考单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC N0:C201548的杂交瘤细 胞株FF/7A8所分泌的。
[0013] 所述的杂交瘤细胞株FF/7A8，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201548。
[0014] 所述的单克隆抗体是以氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后得到的氟苯尼考 胺半琥珀酸酯(FFA-HS)与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得到的。本发明优选 的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)。
[0015] 所述的单克隆抗体可用于制备检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒。
[0016] -种包含所述的单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒是检测氟苯尼考药物残留的酶联 免疫试剂盒。
[0017] 所述的试剂盒可用于氟苯尼考药物残留非诊断目的的检测。
[0018] 本发明进一步提供一种氟苯尼考药物残留的非诊断目的酶联免疫检测方法，该方 法包括以下步骤：
[0019] (1)将氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后的氟苯尼考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)与载体蛋白偶联，将得到的偶联物作为免疫原；
[0020] (2)将氟苯尼考胺(FFA)与载体蛋白偶联得到包被原；
[0021] (3)用步骤（1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201548的杂交瘤细胞株FF/ 7A8；
[0022] (4)用保藏号为CCTCC N0:C201548的杂交瘤细胞株FF/7A8制备单克隆抗体；
[0023] (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；
[0024] (6)样品处理和检测。
[0025] 优选地，免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)，包被原载体蛋白是卵清白蛋白（0VA)。
[0026] 本发明的有益效果是：
[0027] 1、本发明在抗体制备时，采用氟苯尼考胺与琥珀酸酐反应，得到氟苯尼考胺半琥 珀酸酯，将其作为半抗原并与载体蛋白偶联后作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体 能够特异性地识别氟苯尼考。
[0028] 2、本发明的试剂盒和酶联免疫检测方法可用于检测动物性食物如猪肉、鸡肉、鱼、 猪肝脏和鸡肝脏中的氟苯尼考药物残留，而且检测灵敏度、准确度高，精密度好，IC 5Q值仅为 0.21±0.02yg/L。
[0029] 3、本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者身体健康危害相 对较小。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的单克隆抗体与氟苯尼考标准品的间接竞争ELISA反应曲线图，X轴 为氟苯尼考(FF)标准溶液浓度对数值，Y轴为氟苯尼考标准品溶液的光密度值除以"零"孔 光密度值(Β/Βο)。
【具体实施方式】
[0031 ]下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0032]实施例1免疫原和包被原的制备
[0033] 1.3氟苯尼考胺半琥珀酸酯与血蓝蛋白偶联物(FFA-HS-KLH)的制备
[0034] 称取氣苯尼考胺(FFA)247mg( lmmol)，B0C酸圈lmmol)，Na2C〇3l06mg( lmmol) 于50mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷10mL，室温反应过夜。过滤，除掉Na2C03,然后加入琥珀酸 酐200mg(2mmol)，三乙胺lmL，60°C油浴条件下，回流反应Id。蒸干除掉二氯甲烧，加三氟乙 酸2mL，室温水浴反应2-4h，待反应完全滴加三乙胺调中性，用乙酸乙酯洗涤2-3次，合并有 机相，无水硫酸镁脱水后，蒸干得到黄色油状物，即半抗原氟苯尼考胺半琥珀酸酯（FFA-HS)。反应式如下：
[0035] ^ Ο
\ -
[0036] 称取氟苯尼考胺半琥珀酸酯69.4mg，溶于lmL DMF中，加入DCC 60mg和N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS) 34.6mg，室温避光反应8h，反应完全过滤得到A液。取3mLKLH溶于3mL PBS中，为 B液。冰浴条件下，将A液缓慢滴加到B液中，4°C反应8-10h。将产物装入透析袋内，4°C条件下 用PBS透析5d，每天更换透析液3次。得到的即为FFA-HS-KLH。
[0037]
[0038] 1.4氟苯尼考胺卵清白蛋白偶联物(FFA-EDC-0VA)的制备
[0039] 称取氟苯尼考胺24.7mg，溶于100yL DMF中为A液。称取40mg 0VA溶于6mL PBS中， 为B液。将A液缓慢滴加到B液中，然后加入EDC 16mg和NHS 12mg。室温反应过夜。将反应物装 入透析袋内，4 °C用roS透析5d，每天更换透析液3次。得到的即为完全抗原FFA-EDC-0VA。反 应式如下： 0H
[0040] " 〇
[0041] 实施例2单克隆抗体的制备
[0042] 2.1动物免疫
[0043]利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原（FFA-HS -KLH)免疫 Balb/C小鼠（购自湖北省医学科学院实验动物中心）。免疫程序是取含FFA-HS-KLH偶联物50 ~l〇〇yg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。
[0044] 2.2细胞融合和克隆化
[0045] 参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的FFA-HS-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心），免疫程序 为:基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每 间隔2周加强免疫一次，换用不完全