电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途。具体说是由多 氨基化合物修饰普鲁兰多糖，并通过末端氨基与邻二酸酐反应引入pH-敏感的β-羧酸酰胺 键制备而得。普鲁兰多糖衍生物具有肝/肝癌靶向性，能够对弱酸性的肿瘤微环境与细胞内 涵体/溶酶体产生快速响应，实现由负电性向正电性的翻转，可用作药物、基因及影像对比 剂的肝/肝癌靶向载体材料，属于生化医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 生物医用高分子材料是生物材料的重要组成部分，目前在医药领域已得到广泛应 用，如用于疾病的诊断和治疗、损伤组织和器官的替换或修复、合成或再生等。根据不同来 源，可将其分为天然和人工合成的生物医用高分子材料两大类，而天然生物医用高分子材 料来源于自然界，主要包括多糖类与蛋白质类等。
[0003] 多糖(polysaccharide)是单糖通过糖苷键组成的直链或支链聚合物，包括纤维 素、淀粉、葡聚糖、壳聚糖、普鲁兰多糖、黄原胶、肝素、海藻酸、透明质酸、果胶等。多糖资源 丰富、容易获取，具有较好的生物相容性、可生物降解性和较低的毒性，并且表现出一些特 殊的生物活性，如肝素的抗凝血作用，壳聚糖的抗炎抗肿瘤作用，肺炎球菌细胞壁中多糖的 抗原作用等。多糖分子中含有大量的活泼基团（如羟基、氨基与羧基），可以进行化学或生化 修饰，得到不同改性基团的衍生物，加之多糖不同的化学组成与分子质量(几万至几千万）， 形成了其在结构与功能上的多样性。
[0004] 普鲁兰多糖(pullulan)是由出芽短梗霉菌中发酵得来，类似葡聚糖、黄原胶等胞 外水溶性粘质多糖。普鲁兰多糖的结构是由α-l，4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-l，6 糖苷键聚合而成的直链多糖，分子量20~2000 kDa。它是一种水溶性、无毒、无免疫原性、无 致突变、无致癌性的天然多糖，具有良好的成膜、成纤维、易加工等特性。2006年5月19日，国 家卫生部发布了第8号公告，将普鲁兰多糖新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克 力包衣、膜片、复合调味科和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。目前，普鲁兰多糖在医药 领域的应用研究也越来越受到关注。一些研究发现，普鲁兰多糖具有电中性，能够实现血液 中的长循环，并且是肝/肝癌细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特异性配基，具有显著的肝/肝癌靶向性。在之前的研究中，我们制备 了系列基于普鲁兰多糖的纳米载体，结合纳米的被动靶向EPR效应(实体瘤的透过性增强及 滞留效应)和普鲁兰多糖的主动靶向作用，开发抗肿瘤药物或基因的肝癌靶向递送系统，其 中一些表现出良好的肝癌靶向性以及对肝癌的有效抑制作用。综上所述，普鲁兰多糖是一 种性质优良的理想高分子载体材料，在肝病或肝癌治疗领域具有广阔的应用空间。
[0005] 当前，越来越多的纳米体系被开发用于药物、基因以及影像对比剂的载体系统。其 中正电性的纳米体系，如阳离子脂质体，壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨基酯(PBAE)、多聚 赖氨酸纳米粒以及聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM-D)等，能够和负电性的细胞膜相互作 用，通过胞吞的方式有效携载基因、蛋白、多肽以及小分子药物进入肿瘤细胞，而后通过"质 子-海绵"效应逃逸内吞体/溶酶体，从而实现药物的胞内释放。此外，一些具有穿透细胞膜 能力的短肽（穿膜肽，cell penetrating peptides, CPP)，如Tat、小分子鱼精蛋白等，也 带有大量正电荷，通过和细胞膜的相互作用穿透细胞。然而这些正电性的载体系统存在生 物安全性及稳定性等方面的问题(如溶血、易被吞噬系统摄取等），并且缺乏肿瘤靶向性，因 此其体内应用受到极大限制。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物及其合成方法和用途。具有肝癌 靶向性的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，其分子结构中含有多氨基和pH-敏感的β-羧酸酰胺 改性基团，在生理条件下荷负电，可对载体表面的正电荷进行有效屏蔽，从而增加正电性载 体系统的体内稳定性，并实现载体系统的肝癌靶向输送。在肿瘤病灶，羧酸酰胺键可对肿 瘤微环境或内吞体/溶酶体的低pH条件产生快速响应一断键，由负电性翻转为正电性，从而 释放电正性的载体系统，促进携载药物被肿瘤细胞的摄取，提高药物疗效，降低药物毒副作 用。此外，该电荷翻转普鲁兰多糖衍生物本身具有显著的肝/肝癌靶向性，可作为肝病或肝 癌药物高分子前药的载体材料。
[0007] 本发明提供的一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物包括普鲁兰多糖骨架(R1)、多氨基 改性基团(R2)与β_羧酸酰胺改性基团(R3)组成：
其中，所述普鲁兰多糖骨架R1的分子量在20~250 kDa。
[0008] 多胺基改性基团R2为二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1，4-丁二胺。
[0009] β-羧酸酰胺化改性基团R3为顺-4-环己烯-1，2-二羧酸、琥珀酸、马来酸或邻苯二 甲酉支。
[0010] 本发明提供的一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成方法包括以下步骤： 1)普鲁兰多糖的氨基化改性:将普鲁兰多糖与Ν，Ν'_羰基二咪唑溶于无水二甲基亚砜 溶液中，搅拌5~10 min后缓慢滴加至多胺基化合物的二甲基亚砜溶液中，于35°C下持续搅 拌15~30 h，然后将反应溶液转移至超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二甲基 亚砜，透析液冷冻干燥，即得普鲁兰多糖的氨基化改性产物。
[0011] 2)电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成:将上述普鲁兰多糖氨基化改性产物溶解 于无水二甲基亚砜中，加入邻二酸酐化合物，室温下搅拌反应18~36 h，然后将反应产物 转移至用三乙胺调节pH值为8.5~9.5的超纯水中透析处理，除去未反应的小分子物质和二 甲基亚砜，透析液冷冻干燥，即得电荷翻转的普鲁兰多糖衍生物。
[0012] 步骤1)中，普鲁兰多糖在二甲基亚砜溶液中的浓度为5~15 mg/ml;N，N'-羰基二 咪唑与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为丨/!-/!。
[0013] 步骤1)中，多胺基化合物是指二亚乙基三胺、精胺、亚精胺或1，4-丁二胺；多胺 基化合物与普鲁兰多糖分子中糖单元的摩尔比为1/1~3/1。
[0014] 步骤1)和2)中，透析袋截留分子量8~14 kDa。
[0015] 步骤2)中，邻二酸酐化合物是指顺-4-环己烯-1，2_二羧酸、琥珀酸酐、马来酸酐 或邻苯二甲酸酐；邻二酸酐化合物与普鲁兰多糖氨基化改性产物中改性基团的摩尔比为 0.8/1~1.2/1〇
[0016] 上述的电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，在对抗肿瘤药物、基因与影像对比剂载体系 统的肝癌靶向性修饰，以及自身作为肝病/肝癌载体材料中的应用。
[0017] 所述电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，具有显著的肝/肝癌靶向性，在pH 6.5的水性介 质中，能够通过羧酸酰胺键的断裂实现由负电荷向正电荷的翻转。以电荷翻转普鲁兰多 糖衍生物对电正性载体材料进行表面修饰，能有效屏蔽其正电性，提高其在血液循环中的 稳定性，降低其毒性，能够靶向输送所携载化疗药物、基因或影像对比剂至肝癌病灶发挥作 用。以电荷翻转普鲁兰多糖衍生物作为载体材料制备的抗肿瘤药物高分子前药，进入肝癌 细胞后能够逃逸内吞体/溶酶体，实现有效的胞内释药，从而有利于逆转肝癌的耐药。
[0018] 本发明提供了一种电荷翻转普鲁兰多糖衍生物，其显著优点是： 1)合成工艺简单，条件温和，适用范围广泛。
[0019] 2)生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。
[0020] 3)能够对肿瘤微环境与细胞内吞体/溶酶体的低pH条件产生快速响应，通过β-羧 酸酰胺键的断裂实现由负电性向正电性的翻转。
[0021] 4)修饰药物载体系统或自身作为药物的载体材料时稳定性良好。
[0022] 5)具有显著的肝/肝癌靶向性。以其修饰正电性纳米载体时能有效定位并滞留于 肝癌病灶，明显减少正电性纳米载体在肝脏和脾脏中的分布；自身作为载体材料时主要分 布于肝脏和肝癌组织。
[0023] 6)以其修饰正电性纳米载体携载抗肿瘤药物时表现出显著的体内外增效作用， 并降低了药物的体内毒性。
[0024] 因此，本发明在实现肝癌的靶向治疗方面具有广阔的临床应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1是实施例一中电荷翻转普鲁兰多糖衍生物的合成路线； 图2是实施例一中普鲁兰多糖(PL)、二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖(AMPL)及顺-4-环己 烯-1，2-二羧酸单酰胺化-二亚乙基三胺改性普鲁兰多糖(CAPL)的红外图谱； 图3是实施例一中PL、AMPL与CAPL的核磁共振氢谱； 图4是实施例一中聚β-氨基酯(PBAE)/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)复合纳米粒的透 射电镜照片(a)和粒径分布图(b); 图5是实施例一中以电荷翻转普鲁兰多糖衍生物CAPL修饰PBAE/ PLGA复合纳米粒制备 而得的CAPL/PBAE/PLGA纳米载体的透射电镜照片(a)和粒径分布图(b); 图6是实施例一中电荷翻转普鲁兰衍生物pH-响应的电荷翻转示意图； 图7是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA纳米载体在不同pH值下的Zeta电位翻转数据； 图8是实施例一中PBAE/PLGA纳米粒与CAPL/PBAE/PLGA纳米载体在小鼠体内的组织分 布图； 图9是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA复合纳米载体携载化疗药物紫杉醇(PTX)的透射电 镜照片(a)和粒径分布图(b); 图10是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA载药纳米粒中PTX体外释放曲线； 图11是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA复合纳米载体携载血管生成抑制剂康普瑞汀(CA4) 的透射电镜照片(a)和粒径分布图（b); 图12是实施例一中CAPL/PBAE/PLGA载药纳米粒中CA4体外释药曲线； 图13是实施例一中CAPL/PB