硬度可调节的温敏聚合物材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物材料技术领域，具体地，涉及硬度可调节的温敏聚合物材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]生物力学的重要性已被越来越多的研究者关注。生物力学的出现使传统只针对于基因水平疾病的药物受到了强有力的挑战，细胞力学、细胞外基质结构、而或细胞机械传导都可能对许多的疾病发生起关键作用，包括动脉粥样硬化、纤维化、哮喘、骨质疏松、心脏衰竭、癌症，甚至包括广义的医疗残疾如过敏性肠综合症。研究表明，当生长在不同硬度的等价化学表面上时，有许多种类型的细胞可以改变它们自身的形态和基因表达图谱。细胞周围的微环境为细胞提供了复杂的生物化学活性结构和物理调控。在这种环境中，细胞通过感知细胞外基质或相邻细胞来主动探测识别其所在微环境的硬度，并将其感受的机械扰动和环境压力传递到细胞内，调整自身表观遗传学表达。生物力学环境在胚胎发育、组织内稳态和病理学中影响基因的选择性表达，在细胞表观遗传学差异体现中起到了重要的作用。正常肝脏弹性模量不足1500帕，在这种条件下肝星形胶质细胞可保持静息状态。I千帕左右的弹性模量可以保持肺成纤维细胞处于良好的生理水平。然而，当细胞生长在更硬的环境中时(如8-22千帕)就会转变分化形成不同的表型。研究证明，持续增加的外部机械力可以诱导更多的细胞外基质基因表达和基质沉积，从而导致纤维化的形成，引起体内器官系统功能障碍。
[0003]聚合生物材料可作为体外细胞培养基质，其中生物力学性质可调的水凝胶为研究细胞在不同软硬刺激中对于细胞外基质的条件反应提供了有力的工具。体外模型的建立对于了解伤口愈合和疾病发病的机制有着至关重要的作用，尤其是在细胞的表型和功能发挥的研究中的更是不可或缺的。然而，大多数的生物力学研究主要集中在机械条件如何影响粘附细胞活性以及它们细胞外基质的形成，生物力学调控细胞表观遗传学的研究仅局限在原位细胞，细胞收集对细胞的影响作用往往被研究者们所忽略。如何在不损伤细胞特性的前提下消化、重悬细胞仍然具有很大的挑战性。
[0004]成功的再生医学治疗必须考虑细胞的天然特性，使得细胞能够激发对于组织修复有利的信号通路从而融入天然的组织结构。内稳态是维持细胞正常的生理功能的动态过程，其中包括所有与细胞生存所需的内部和外部环境。体外细胞培养收集技术包括酶消化和物理剥离是细胞传代中最经常采用的方法。传统常规细胞收集方法由于酶消化蛋白水解或机械刮削分离的作用而得到的单细胞或细胞团会造成细胞或细胞与细胞外基质连结地损失。由于酶促消化可以极大地改变了细胞自身所处的环境，例如胰酶会强效裂解几乎全部蛋白肽链中靠近羧基端的赖氨酸或精氨酸，所以很可能会对细胞的特异性表达造成负面影响，考虑其在培养条件上所造成的差异(如细胞外基质片段化)更有可能改变细胞的形态以及基因表达。研究表明胰酶消化会破坏细胞固有结构和表观遗传学特征，细胞中组蛋白甲基化、乙酰化水平经胰酶处理后明显下降。物理剥离方法如细胞刮刀会显着降低细胞的成活率，研究发现，物理刮剥的方法可能造成高达30%的细胞死亡。而且现在还不能确定这死细胞是否会释放细胞内的物质对存活下来的细胞造成影响。值得期待的是，如果常规的细胞培养不会对细胞自身表达造成干扰，由此便可区分实验结果是否是实验真正想要得到的结果，而不是因为由于培养技术条件所限而受到影响出现的假阳性数据。
[0005]因而，目前关于细胞培养的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于细胞培养、可以非侵入性收集细胞、调控细胞基因表达与细胞形态、或者维持细胞代次间稳定性，保存细胞表面受体与细胞外基质免受破坏的硬度可调节的温敏聚合物材料。
[0007]在本发明的一个方面，本发明提供了一种硬度可调节的温敏聚合物材料(可简称水凝胶)。根据本发明的实施例，该硬度可调节的温敏聚合物材料是由温敏交联材料和非温敏交联材料三维网状交联形成的，其中，温敏交联材料为选自N-异丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基哌啶、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N，N_ 二乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯甲基酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基吡咯烷、N，N_乙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基甲基其他可、N-乙基丙烯酰胺中的至少一种，非温敏交联材料为选自人工合成生物材料和天然生物材料中的至少一种，人工合成生物材料为选自丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一种，天然生物材料为选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的至少一种。发明人发现，根据本发明实施例的该水凝胶具有良好的硬度可控性、温度敏感性和扩增支持性，应用于细胞培养时，可随所培养细胞需求改变硬度或通过主动调控硬度调节细胞基因和形态表达，同时在体温范围内呈疏水、团缩状态，当其处于室温时即变为亲水、膨胀状态，且两种状态可随温度变化可逆的改变，且在水凝胶表面贴附的细胞可反复在水凝胶表面生长，其生长状态不会因细胞收集而间断；另外，通过降低环境温度可使水凝胶表面贴附的细胞主动脱离水凝胶，从而完整的保存细胞表面受体与细胞外基质，维持细胞特性在代次传递间的统一性，及表观遗传学的稳定性。
[0008]根据本发明的实施例，温敏交联材料为N-异丙基丙烯酰胺，非温敏交联材料为丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯。
[0009]根据本发明的实施例，温敏交联材料和非温敏交联材料的质量比为1:(0.1?2.0)。
[0010]根据本发明的实施例，硬度可调节的温敏聚合物材料的硬度弹性模量为1帕?100千帕，优选100?1500帕。
[0011]根据本发明的实施例，硬度可调节的温敏聚合物材料的相转变临界温度为O?120摄氏度，优选为4?33摄氏度。
[0012]根据本发明的实施例，温敏交联材料和非温敏交联材料三维网状交联是在基底材料的表面上进行的，其中，所述基底材料为玻片、塑料、金属和硅胶中的至少一种，优选为玻片、细胞培养皿、硅胶、PMMA、PCL中的至少一种。
[0013]根据本发明的实施例，基底材料的表面预先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯进行修饰。
[0014]在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将温敏交联材料、非温敏交联材料和交联剂混合，并使所得到的混合物进行交联反应，得到硬度可调节的温敏聚合物材料。
[0015]发明人发现，该方法工艺流程简单、可自动化生产、可实现大规模生产，同时可根据实际需求制备出各种形状的聚合物材料系统，如圆形、椭圆形、多边形等，且所制得的聚合物材料系统厚度、大小均一，各种尺度级别(>lmm)均可实现，另外，制得的聚合物材料具有前面所述的聚合物材料的全部特征和优点，在此不再一一赘述。
[0016]根据本发明的实施例，制备前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料的方法进一步包括:将温敏交联材料、非温敏交联材料和交联剂混合，得到预聚混合物;将预聚混合物置于基板的表面上，并在预聚混合物上覆盖基底材料，然后使预聚混合物进行交联反应。其中，基底材料为选自玻片、细胞培养皿、硅胶、PMMA、PCL及各类塑料和金属等中的至少一种。根据本发明的实施例，制备前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料的方法进一步包括:将温敏交联材料和部分交联剂混合，将得到的温敏混合物修饰于基底材料表面，得到温敏基底材料;将非温敏交联材料和余量交联剂混合，并将得到的非温敏混合物置于基板的疏水表面上，然后将温敏基底材料覆盖于非温敏混合物上，使其进行所述交联反应。
[0017]根据本发明的实施例，将温敏混合物修饰于基底材料表面进一步包括:将温敏混合物置于基底材料的表面，并于20?60摄氏度下反应5?30分钟或于紫外下照射10?1000秒，然后将所得基底材料进行烘干处理。
[0018]根据本发明的实施例，上述制备前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料的方法中，交联反应是通过化学成胶、光学成胶、物理成胶、热成胶、电解质成胶中的至少一种进行的。
[0019]根据本发明的实施例，化学成胶的条件为于室温下反应5?30分钟。根据本发明的实施例，光学成胶的条件为于光下照射10?1000秒，其中，光学成胶采用的光为紫外光、可见光、红外光中的至少一种。
[0020]根据本发明的实施例，上述制备前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料的方法中采用的基板的表面预先利用十八烷基三氯硅烷进行修饰，基底材料的表面预先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯进行修饰。
[0021]在本发明的再一方面，本发明提供了前面所述的硬度可调节的温敏聚合物材料在以下之一中的用途:a.调控细胞基因表达与细胞形态;b.非侵入性收集细胞;c.维持细胞代次间稳定性，保存细胞表面受体与细胞外基质免受破坏。发明人发现，将上述水凝胶用于