一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法。
【背景技术】
[0002]4-雄烯二酮是生产甾体激素类药物的重要中间体。目前我国的年产量大约为3000-4000吨，该中间体除了满足国内制药企业的需求外，还有一定量的出口。
[0003]目前4-雄烯二酮的生产主要采用微生物生物转化工艺，即发酵工艺，以植物甾醇为原料，在分支杆菌的作用下，将植物留醇降解为4-雄烯二酮。然后再通过有机溶剂提取，将4-雄烯二酮从发酵液中提取出来，并精制成为合格的中间体产品。
[0004]4-雄烯二酮的发酵水平主要取决于菌种的生产能力，只有不断地进行菌种选育，才能获得产量提高的高产菌种，从而提高4-雄烯二酮的发酵水平。
[0005]菌种选育的主要方法为诱变育种，即采用物理诱变剂或化学诱变剂处理微生物菌种，使其基因发生突变，然后从大量的突变菌种中筛选出极少数的产量提高了的突变菌种，经验证后用于发酵生产，从而提高发酵水平。
[0006]获得高产突变菌种的主要难点是:微生物在经过诱变剂处理后，基因突变发生的位点不确定，导致突变后菌种的生理生化特性变化不确定，对4-雄烯二酮产量的影响不确定;而且在突变菌种中，绝大多数突变菌株对4-雄烯二酮的生产能力没有变化或者降低，只有极少数的突变菌种对4-雄烯二酮的生产能力得到提高，此种突变菌种出现的几率极低，约为千分之一至万分之一。因此，常规的诱变育种方法需要使用大量的人工，进行大量的筛选工作，需要数月或数年的时间，才能偶然获得一株高产菌种。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法，以全部或部分解决上述技术问题。
[0008]为了解决上述问题，本发明公开了一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法，包括以下步骤:
[0009]步骤(1)、菌种的培养:将甘油管内分支杆菌的种子接种于含有种子培养基的第一摇瓶中，将所述第一摇瓶放置于第一摇床上振荡培养，所述第一摇床的转速为150?190r/min，温度为28?32°C，培养时间为20?48h，得到菌种培养液；
[0010]步骤(2)、诱变处理:用无菌生理盐水稀释所述种子液得到种子稀释液，对所述种子稀释液进行诱变处理，得到诱变菌种培养液；
[0011 ]步骤(3 )、诱变菌种培养液的涂布与培养:用灭菌后的含量为I %?2 % (v/v)的甘油水溶液稀释所述诱变菌种培养液，并将稀释后的不同浓度的诱变菌种培养液涂布在分离平板培养基上，将装载有所述分离平板培养基的平板倒置于28°C?32°C培养箱中，培养3-7天；
[0012]步骤(4)、单菌落接种及摇床发酵:从所述分离平板上选取单菌落，将选中的单菌落接种到装有分离平板培养基的无菌培养皿中以供后续使用，并同时此单菌落接种在装有发酵培养基的微型发酵管中，所述发酵培养基中含有植物留醇，之后盖上透气管盖，将所述微型发酵管摆放在特制摇床板上，进一步将所述特制摇床板放入第二摇床上，所述第二摇床的温度为28°C?32°C，转速为150?190r/min，旋转时间为4?7天，得到发酵液，其中每个特制摇床板可放置100-200个所述微型发酵管;每层摇床可放置4块所述特制摇床板；
[0013]步骤(5)、发酵液的萃取与薄层层析:待发酵结束后，将所述微型发酵管取下，向每个微型发酵管中加入乙酸乙酯进行萃取，盖上密闭管盖，将密闭的微型发酵管放于漩涡混合器上混合，混合结束后静置分层，从乙酸乙酯层中取样，采用双向层析的方法对样品进行检测，判断不同微型发酵管内的菌种将植物留醇转化为4-雄烯二酮的能力，进一步筛选出转化能力较强的所需菌种。
[0014]可选地，在所述步骤(5)中，所述双向层析的方法包括:
[0015]绘制硅胶板:在硅胶板的上部和下部分别画出一条平行于长边的边线，并在每条边线上均匀标记预设数目的标记点，再于两条边线的中间画出一条平行于所述长边的中线；
[0016]取样和点样:使用不同毛细管吸取不同样品，按照所述样品的吸取顺序，依次将吸取的样品点样在两条边线的标记点上，同时将所述植物留醇和所述4-雄烯二酮作为对照溶液，分别点样在剩余的标记点上，点样完成后吹干处理；
[0017]展层处理:先将所述硅胶板的一边放入层析缸中进行展层，待溶剂的前沿升至所述中线时，取出所述硅胶板并吹干;再将所述硅胶板的另一边放入所述层析缸中进行展层，待所述溶剂的前沿升至中线时，取出所述硅胶板并吹干；
[0018]菌种筛选:用10%?40%(v/v)的硫酸水溶液喷于所述硅胶板的表面，然后将所述硅胶板放入烘箱内进行加热显影，烘箱温度为100?130°C，烘烤时间为10?20min，显影后根据4-雄烯二酮斑点和剩余的植物留醇斑点的大小判定菌种的转化能力，选取转化能力较强的所需菌种，其中所述植物留醇斑点越小，同时所述4-雄烯二酮斑点越大，表明所述菌种的转化能力越强。
[0019]可选地，所述硅胶板的尺寸为10mmX 200mm，包括40个标记点；
[0020]所述溶剂包括环己烷和乙酸乙酯，所述环己烷和所述乙酸乙酯的体积比为3:1.5
?3:2.5ο
[0021]可选地，所述微型发酵管为耐高温灭菌的透明塑料管；
[0022]所述透气管盖设有开孔，在所述开孔中放置棉花，用于通气并防止染菌。
[0023]可选地，所述特制摇床板的长度为420mm，宽度为260mm，厚度为25mm，每块所述特征摇床板上设置有128个用于放置所述微型发酵管的凹槽；
[0024]所述第二摇床为双层摇床，每层可放置4块所述特征摇床板，所述第二摇床可放置1024个所述微型发酵管。
[0025]可选地，在所述步骤(I)中，所述种子培养基中甘油的含量为0.5?2.0g/100ml、蛋白胨的含量为0.5?2.0g/100ml、牛肉膏的含量为0.5?2.0g/100ml、吐温_80的含量为0.1?1.0g/100ml，所述种子培养基的pH为6.0?7.0 ；
[0026]所述分离平板培养基包括所述种子培养基的全部组成，还包括琼脂，所述琼脂的含量为 1.5?2.5g/100ml。
[0027]可选地，在所述步骤(2)中，所述无菌生理盐水与所述种子液的体积比为1:1;
[0028]所述对所述种子稀释液进行诱变处理为:
[0029]对所述种子稀释液进行紫外灯光照射；
[0030]或，采用亚硝基胍或亚硝酸对所述种子稀释液进行化学试剂诱变处理。
[0031]可选地，在所述步骤(4)中，所述发酵培养基中植物甾醇的含量为2.0?5.0g/10ml、玉米浆的含量为0.5?2.0g/100ml、黄豆饼粉的含量为0.5?2.5g/100ml、甘油的含量为0.I?I.0g/100ml、KH2P04的含量为0.I?0.5g/100ml、豆油的含量为0.2?2.0g/100ml和聚氧乙烯氧丙烯甘油的含量为0.01?0.lg/100ml。
[0032]可选地，所述方法还包括菌种复筛，包括以下步骤:
[0033]将所述所需菌种接种到第二摇瓶内，采用所述步骤(I)的方法对所述所需菌种进行培养，得到所需菌种培养液；
[0034]将所述所需菌种培养液接种到装有所述发酵培养基的第三摇瓶内，将所述第三摇瓶放置于第三摇床上，所述第三摇床的温度为28?32°C，转速为150?190r/min，旋转时间为4?7天，得到所需发酵液；
[0035]向所述所需发酵液中添加乙酸乙酯，将混合物置于所述漩涡混合器中混合，混合结束后静置分层，用甲醇稀释提取的乙酸乙酯层并取样，之后采用高效液相色谱法测定所需样品中4-雄烯二酮的含量，从所述所需菌种中筛选出转化能力较强的目标菌种。
[0036]可选地，所述方法还包括:
[0037]菌种保藏:将所述目标菌种接种到装有所述种子培养基的第四摇瓶中，将所述第四摇瓶放入第四摇床中进行培养，所述第四摇床的转速为150?190r/min，温度为28?32°C，培养时间为20?48h，得到目标菌种培养液，混合相同体积的目标菌种培养液和含量为40% (v/v)的甘油水溶液，分存于冻存管内，置于-80°C冰箱中保藏。
[0038]与现有技术相比，本发明包括以下优点:
[0039](I)菌种筛选的效率得到提高:采用摇瓶发酵时，一次摇床实验最多只能培养几十个摇瓶;而本发明采用微型发酵管，一次摇床实验可以培养上千个微型发酵管，可见本发明的方法提高了单位时间内菌种培养的数量，缩短了对预设数目菌种培养的时间，因此提高了菌种筛选的效率。
[0040]实验统计，采用摇瓶筛选菌种时，每个实验人员平均每天最多可以完成对10株菌种的筛选操作，其中包括培养基准备，灭菌，接种，产物提取，测试分析等工序;而采用微型发酵管筛选菌种时，每个实验人员平均每天至少可以完成对200株菌种的筛选操作，菌种筛选的效率至少可以提高20倍。
[0041](2)提取过程得到简化:采用摇瓶发酵时，在发酵结束后，需要从每个发酵摇瓶中定量取出发酵液，再向取出的发酵液中添加有机溶剂进行提取;而本发明采用微型发酵管，可以在发酵结束后，直接将溶剂添加到微型发酵管中进行提取，简化了提取步骤，节省了操作时间。
[0042](3)样品检测方法得到简化:采用双向薄层层析法替代高效液相法，实验人员每天可检测数百个样品，提高了菌种筛选的速度，菌种筛选的效率得到大幅度提高。
【附图说明】
[0043]图1是本发明实施例所述的一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法的流程图；
[0044]图2是本发明示例I所述的一种高效的4-雄烯二酮菌种选育方法的流程图；
[0045]图3是本发明示例I所述的带有编号的分离平板的