Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及HSV1-H129-BAC及其变体的构建方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 单纯疱疼病毒(Human Herpesvirus，HSV)属于α疱疼病毒亚科，该型病毒共分为两 种类型，I型单纯疱疹病毒和Π 型单纯疱疹病毒，即HSV1和HSV2ASV1和HSV2都是DNA病毒， 其中HSV1基因组全长为152kb，共编码超过80种不同的病毒蛋白，病毒质粒大小约180nm。 HSV1对动物感染宿主范围较广。常用实验动物为家兔、豚鼠及小鼠等。HSV1可以在多种细胞 中增殖，常用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞）、人胚肾细胞以及地鼠肾细胞等传代细胞培养分 呙病毒。
[0003] HSV1-H129是一个典型的顺行标记神经环路的工具病毒，其具有严格顺向跨突触 的特性，适合标记多级神经输出环路的结构；其可携带多种标示物，跨突触后可复制，信号 不衰减，这种未改造的原始株可被直接用于中枢及外周感觉神经环路的研究。在灵长类动 物的大脑中，HSV1-H129也具有同样的顺向跨突触特性，使其成为极具潜力的示踪工具。然 而，在顺行标记神经环路的应用中，对HSV1-H129的检测却比较困难，目前常通过免疫组织 化学或免疫组织荧光等方法对其进行检测，但这些实验操作繁琐复杂，实验成本较高，最主 要的是对抗体的要求较高，否则很难得到准确的实验结果，这大为限制了 HSV1-H129在顺行 标记神经环路中的应用。
[0004] 众所周知，疱疹病毒是一类大分子量的DNA病毒，其基因组全长一般都超过100kb， 要在如此巨大分子量的基础上研究病毒单个基因的功能和致病机理十分困难，基因组本身 不能长时间保存，且不能自我复制，更不能进行分子生物学的突变改造等一系列的实验操 作。也因此，使得上述实验及对疱疹病毒作为工具病毒的其他应用，或基于该病毒的药物 筛选等应用都难以进一步得到发展。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC，该病毒 带有细菌人工染色体BAC，能在特定的细菌内（如0町(《、0￥380』1^50、0￥330和631783等)保 持低拷贝的自我复制，解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、不能自我复制、不 方便进行分子生物学突变改造的缺点。且该病毒带有GFP报告基因，大大拓展了疱疹病毒作 为工具病毒的应用前景。
[0007] 本发明的第二目的在于提供一种所述的I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的 构建方法，通过该方法能构建H129-BAC的感染性克隆，也能对H129-BAC基因组进行分子水 平的改造，包括插入外源基因、缺失一个或者多个病毒基因等，这样构建了一个基于BAC的 遗传改造平台，为HSV的复制机制和致病机理提供了研究工具，具有巨大的应用价值。
[0008] 本发明的第三目的在于提供所述的I型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC具有和野生型病毒相似的生物学特性，可以通过报告基因 GFP的 表达情况来观测重组病毒在细胞内的感染情况，与H129-BAC相比，重组病毒H129-GFP-BAC 和HI 29-mGFP-BAC的GFP表达信号更强，应用更方便。
[0009] 本发明的第四目的在于提供所述的I型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建 方法，该方法简单可行，且通过应用该方法可使得更多H129-BAC的变体的实现变为可能，赋 予HI 29-BAC更多的变体种类，具有更多的应用前景。
[0010] 本发明的第五目的在于提供所述的病毒在顺行标记神经环路中的应用，HSV1-H129病毒是目前已知的少有的顺向跨突触传播的病毒，可用于标记神经环路，本申请提供 的HI 29-BAC自带荧光信号，可使其在神经环路研究中更为方便;其变体病毒含有2-3个拷贝 的GFP基因，比H129-BAC的应该信号更强，荧光效率高，荧光色泽与背景色泽对比鲜明，标 记后能保持生物学活性和免疫活性，标记方法简单、快速，安全无毒。
[0011] 本发明的第六目的在于提供所述的病毒在病毒药物筛选中的应用。
[0012] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0013] 一种I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC，所述感染性克隆H129-BAC通过在 H129的第46616与46617位碱基之间插入BAC序列得到；
[00M] 所述BAC序列为pUS-F5质粒使用Hindlll酶切所得，所述pUS-F5质粒序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0015] H129的GenBank号为：GU734772.1;BAC之上包含GFP基因，因而改造得到的H129-BAC病毒带有GFP蛋白。
[0016] 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)是一种以F质粒(卩_ plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，BAC最大的优势在于具有容纳100-300kb 外源插入片段的能力，能稳定遗传，克隆入BAC载体的基因组在传代中不会轻易发生缺失、 重组和嵌合现象，并且可以在E.coli中进行各种基因操作，方便、安全而又快捷。
[0017] 本申请基于BAC的大基因组对HSV1-H129进行改造就是利用F因子的遗传优势而建 立的，且进一步的，本申请优选在其中添加了绿色焚光蛋白（Green Fluorescent Protein， GFP)作为报告基因/蛋白，所改造得到的HI 29-BAC具有以下优点：
[0018] 1)、H129-BAC病毒中的BAC序列解决了因疱疹病毒基因组过大而不能长时间保存、 不能自我复制、不方便进行分子生物学突变改造的缺点。此外，虽然相比野生型HSV1-H129 病毒多加了 一段约9kb大小的BAC基因序列，但是其在蛋白质印迹中的敏感度、效果、生物活 性和与抗体结合的特异性等发面没有任何的弱化。
[0019] 2)、病毒中的GFP蛋白DNA分子量小，只有0.72Kb，与目的基因融合后不影响目的基 因的结构功能，大量表达对细胞也无毒性，且对H129-BAC病毒的感染性无影响，得到的病毒 为感染性克隆，可直接作为工具病毒使用。
[0020] 3)、GFP可自发荧光，便于在实验中对其检测。通过GFP的表达，能够更好的更直接 观察病毒的感染情况，由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源 反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无 法比拟的。
[0021 ] 4)、H129-BAC病毒能够在间接免疫荧光法（IFA)和蛋白质印迹法(western blot) 实验方法的配合下深入了解HSV1病毒编码的蛋白功能，从而为有效地预防和治疗由于该病 毒引起的疾病以及HSV1病毒疫苗的研发提供理论基础。
[0022]如上所述的I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法，包括以下步骤： [0023] 1)、以野生型H129病毒基因组为模板，扩增其同源重组臂序列并将其克隆到含有 BAC序列的pUS-F5载体中，得到同时含有H129同源重组臂序列及BAC序列的质粒；
[0024] 2)、将所述同时含有H129同源重组臂序列及BAC序列的质粒线性化并与野生型 H129病毒转染至同一细胞中，筛选GFP阳性细胞并从中提取得到H129-BAC的总基因组DNA; [0025] 3)、将所述含有HI29-BAC的总基因组DNA通过转化至细胞中并根据所述质粒抗性 筛选培养得到感染性克隆H129-BAC。
[0026] 该构建方法能构建H129-BAC的感染性克隆，也能对H129-BAC基因组进行分子水平 的改造，包括插入外源基因、缺失一个或者多个病毒基因等，为HSV的复制机制和致病机理 提供了研究工具，具有巨大的应用价值。
[0027]优选的，如上所述的I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法，在步骤2) 中，用于转染的细胞为293T细胞。
[0028]优选的，如上所述的I型单纯疱疹病毒感染性克隆H129-BAC的构建方法：
[0029] 在步骤3)中，所述细胞为DH10B。
[0030] 如上所述的I型单纯疱疹病毒HI 29-BAC的变体病毒，包括:H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC；
[0031 ] 所述HI 29-GFP-BAC通过在HI 29-BAC基因组的UL37与UL38基因之间插入CMV-p+GFP +zeoR序列得到;GFP和zeoR的序列分别如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示 ；
[0032] 所述 H129-mGFP-BAC 通过在 H129-GFP-BAC 的 UL10 和 UL11 基因之间插入 CMV-p+mGFP +kanR序列得到;mGFP和kanR的序列分别如SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示。
[0033] 与HI 29-BAC相比，变体病毒HI 29-GFP-BAC、HI 29-mGFP-BAC的GFP表达信号更强，应 用更方便；CMV-p为CMV的promoter序列；GFP基因为Gene ID为20473140;mGFP通过以pCAG-mGFP(Addgene公司，货号为14757)为模板扩增得到。
[0034] 如上所述的I型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法，包括：
[0035] 1)、将目的基因克隆至载体构建基因盒并将得到的基因盒扩增；
[0036] 2)、将1)中得到的扩增产物转化至含有H129-BAC的感受态细菌中得到变体病毒克 隆。
[0037] 该方法借助Red同源重组系统对病毒基因进行特异性的基因敲除、基因替换、外源 基因插入等一系列的分子生物学的改造，可赋予H129-BAC更多的变体种类，具有更多的应 用可能。例如，基于H129-BAC的遗传改造平台，可以缺失病毒的Tk基因，使之在vero细胞内 正常增殖，同时无法在神经元内传播;进而通过AAV辅助病毒系统补偿Tk，可实现跨一级突 触传播，应用于示踪神经环路，病毒扩增容易。
[0038] 优选的，如上所述的I型单纯疱疹病毒H129-BAC的变体病毒的构建方法，在步骤1) 中：
[0039]当目的变体病毒为H129-GFP-BAC时，