一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产胆盐水解酶变异体的基因工程菌及其制备方法，属于酶工程领 域。
【背景技术】
[0002] 胆汁是哺乳动物对摄入的脂肪进行初级消化的物质，其主要成分胆汁酸（bile acids)在体内以钠盐或钾盐的形式存在，简称胆盐(bile salts)。胆盐由盐初级胆汁酸和 次级胆汁酸盐组成。初级胆汁酸盐，由肝细胞合成，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸和 牛磺酸结合的产物;次级胆汁酸盐，是初级胆汁酸盐在肠道中受细菌作用生成的脱氧胆酸 和石胆酸及其在肝中生成的结合产物。由于胆汁酸作为一种信号物质，在生物循环中，参与 了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，因此，研究人员认为改变胆汁酸的组成和流量 可以作为一种治疗代谢综合征的新方向。
[0003] 胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是 降解胆汁的主要组成成份一一共辄胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共辄胆酸水解 成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐 水解酶的生理作用体现在两个方面:一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和 降低胆固醇水平等;二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的 肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
[0004] 目前发现的野生型的胆盐水解酶具有广泛的底物特异性，能够水解多种结合胆 盐，而运用基因工程手段获得底物专一性较高的胆盐水解酶将为研究BSH作用于宿主和菌 体提供技术平台，对运用BSH调节宿主健康状况，改善微生物在复杂肠道环境的生存具有重 要意义。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明提供了一种产胆盐水解酶变异体的大肠杆菌基因工程 菌，所述大肠杆菌基因工程菌生产的胆盐水解酶底物专一性得到显著提高，仅对胆盐中的 甘氨(GCA)和牛磺(TCA)结合胆盐具有水解能力。
[0006] 所述大肠杆菌基因工程菌，表达氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的胆盐水解酶。 [0007]在本发明的一种实施方式中，所述胆盐水解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌基因工程菌是以Escherichia coli BL21 (DE3)为宿主、pET-20b (+)为载体构建得到的。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，是先扩增 或者化学合成SEQ ID N0.2所示的编码产胆盐水解酶变异体的核苷酸序列，然后连接到 pET-20b( + )载体上，调整多克隆位点处的序列以防止胆盐水解酶发生移码突变，得到的重 组载体再转化到Escherichia coli BL21(DE3)中；筛选得到正确的转化子，即为大肠杆菌 基因工程菌。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述构建方法，具体是：（1)采用化学合成或者PCR扩 增的方法得到含有氨基酸序列如SEQ ID N0.1、核苷酸序列如SEQ ID N0.2的bshlv基因片 段(两端分别含有BamHI、Xh〇I酶切位点）；（2)bshlv基因片段用BamHI和Xhol双酶切后连接 到大肠杆菌表达载体pET-20b( + )，得到重组载体pET-20b( + )-bsh;(3)敲除重组载体pET-20b( + )-bsh中Ndel到BamHI之间的密码子，得到重组载体pET-20b( + )-bshlv;(4)重组载体 pET-20b( + )_bshlv转化至Escherichia coli BL21(DE3)，经筛选鉴定获得重组菌 Escherichia coli BL21(DE3)-pET20b(+)_bshlv。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种制备底物专一性提高的胆盐水解酶的方法，是构 建重组表达氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的胆盐水解酶的重组大肠杆菌，然后培养重组 大肠杆菌，收集重组菌的菌体，依次经过超声破壁、分步超滤、分子筛纯化获得单一重组蛋 白，即为底物专利性提高的胆盐水解酶。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是收集菌体，用0.1M、pH 6.0的磷酸盐缓冲 液洗涤离心2次，并重悬，超声破碎5min，离心收集上清液，经过截留分子量为30kDa的超滤 膜，透过液再经过截留分子量为20kDa的超滤膜，未透过液经具有分子筛作用的凝胶色谱纯 化获得单一重组蛋白。
[0013] 本发明还要求保护所述大肠杆菌基因工程菌生产得到的胆盐水解酶，以及该胆盐 水解酶在食品、农业或制备药物方面的应用，尤其是在制备微生态制剂、药物表达载体或饲 料添加剂方面的应用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明的胆盐水解酶变异体在大肠杆菌中实现了过量表达，获得了较高的产量； 经过超滤与分子筛的纯化工艺获得纯度较高的重组蛋白。本发明的基因工程菌生产的胆盐 水解酶变异体蛋白，具有显著提高的底物专一性，仅对宿主六种主要结合胆盐中的甘氨 (GCA)和牛磺(TCA)结合胆盐具有水解能力，酶活分别为37.51U/mg和69.74U/mg。本发明为 开发改善哺乳动物胆汁组成、改善代谢综合征的重组蛋白产品奠定了基础，在医药、农业等 领域具有应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1:蛋白电泳（SDS-PAGE)实验结果;Μ:蛋白质分子量标准；1:含有pET-20b (+ )的 E. coliBL21 (DE3)菌株细胞提取液;2:经过0.1 mM IPTG诱导后的重组菌的细胞提取液。
[0017] 图2:重组菌的表现型分析;WT:含有pET-20b( + )的E. coli BL21 (DE3); BSH1:表达 野生型酶蛋白BSH1的E. coli BL21 (DE3);BSH变异体:表达胆盐水解酶变异体的E. co 1 iBL21 (DE3)〇
[0018] 图3 :纯化后胆盐水解酶变异体的蛋白电泳（SDS-PAGE)分析;Μ:蛋白质分子量标 准;3:经过纯化后的胆盐水解酶变异体。
[0019]图4:底物特异性比较;六种底物分别为甘氨结合胆盐(GCA)、甘氨脱氧结合胆盐 (GDCA)、甘氨鹅脱氧结合胆盐(GCDCA)、牛磺结合胆盐(TCA)、牛磺脱氧结合胆盐(TDCA)、牛 磺鹅脱氧结合胆盐(TCDCA)。
【具体实施方式】
[0020] 胆盐水解酶活性鉴定方法:滴加5yL受体菌菌液至别含有0.01 %猪胆盐(w/v)的LB 固体平板(含l〇〇yg/mL氨苄青霉素和24yg/mL IPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检 验胆盐水解酶的活性。
[0021] 胆盐水解酶酶活测定方法:取10yL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μ L，加入10yL结合胆盐(200mM)混合，于37°C孵育30min，加入等体积的15 % (w/v)三氯乙酸终 止反应，离心后取10yL上清液与190yL茚三酮试剂混合，于100°C反应15min，冷却后于570nm 处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为:〇.5mL l%(w/ v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液），1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓 冲液。
[0022]实施例1:重组菌的构建及鉴定
[0023] 1)以前期筛选鉴定的含有胆盐水解酶变异体编码基因（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2)的重组载体pNZ8148-bshlv的DNA为模板，进行PCR扩增， 引物序列为：
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