一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]动物细胞生物反应器微载体培养技术是当前生物制药行业贴壁依赖性细胞培养的领先技术。微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明的小颗粒。能使贴壁依赖性细胞贴附在颗粒表面进行悬浮培养，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。
[0003]自1967年Van Wezel第一个用DEAE-Sephadex A 50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳素微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。我国目前使用的商品化微载体主要有:如GE公司的Cytodex 1、Cytodex I1、Cytodex III和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、B1silon、Cultispher G等，均为进口产品，但是价格昂贵，目前市场价已达每公斤3?10万元人民币，还出现供不应求的现象，而我国国产的微载体大多数尚在研制之中，或者生产规模较小，难以工业化生产，不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，是限制我国动物细胞培养技术从转瓶细胞培养工艺向生物反应器微载体培养工艺转型的技术瓶颈之一。
[0004]目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药行业仍然沿用传统的转瓶(滚瓶)培养工艺。该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批向差异大，且容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数制药企业的生物医药产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用生物反应器微载体大规模培养技术。
[0005]因此，开发适合于我国生物医药领域多种动物细胞培养用的微载体，具有广泛的应用前景，对促进我国生物反应器微载体大规模细胞培养技术的发展具有重要的历史意义。
[0006]淀粉是一种廉价、易得、绿色的多糖生物材料，被广泛应用于食品、医药、纺织等行业。淀粉结构中的大量羟基基团为淀粉化学改性提供了良好载体，已成为最具发展潜力和应用前景的新型高分子材料之一。以淀粉为原料制备的淀粉微载体，有微孔结构、表面积较大且富含羟基等易接近的活性基团，因而可以有效吸附自由组分，成为细胞能够贴壁生长的良好原材料，目前，淀粉微载体尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用。该制备方法具有以下特点:采用普通的食用淀粉，原料无毒性，采取乳化成球常温下交联固化，DEAE再次偶联修饰，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，易于形成工业化生产，使淀粉微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养。
[0008]本发明提供一种细胞培养用微载体的制备方法，步骤如下:
(1)首先配制糊化的淀粉碱溶液:将一定量的淀粉溶解于纯水中，搅拌加热至糊化，再加入一定量的NaOH溶液，搅拌冷却形成均一稳定的水相溶液；
(2)油水相混合制球:将无毒高密度油、异辛烷、分散剂和一定量的乳化剂混合搅拌，形成均一的油相溶液后，缓慢加入水相溶液，搅拌，形成均一稳定的混合相；
(3)交联固化成球:再将交联剂缓慢加入到混合相中，常温下搅拌交联反应一定时间；
(4)除油洗涤:除去上层的油乳液，将固形物用表面活性剂进行除油，再依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，抽滤得到湿微球；
(5)偶联DEAE-HCl:称取一定量的湿微球，加入一定浓度的NaOH溶液搅拌，再加入一定浓度的DEAE-HCl溶液，搅拌偶联反应一定时间；
(6)洗涤:依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，得到细胞培养用微载体；
作为优选，步骤(6)后还包括将得到的微载体保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中的步骤。
[0009]配制淀粉碱溶液的目的是加热使淀粉糊化，分子间的氢键断开，带电荷才能均匀分布在溶液中，使其成为均一的胶体溶液；
油相中异辛烷的存在，会降低淀粉溶液在油相中的溶解度，并且能够完全乳化成圆滴状，使其能够固化成球；
DEAE (二乙胺基乙基，diethylaminoethyl )是一种弱碱性的叔胺基团，中心N原子带有正电荷，具有离子交换功能，同时也可以使细胞贴附在微载体表面;偶联DEAE-HCl后，贴壁细胞可以完全贴附在淀粉微载体表面，正常生长。
[0010]将微载体保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中的效果为:能够保持微载体的外观，同时抑制细菌的生长，保持微载体的洁净。
[0011]优选地，步骤(I)中，所述淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、大豆淀粉、玉米淀粉中的一个或者任意两者的组合；
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5?2mol/L;
作为优选，所述水相溶液中，淀粉的质量体积百分比为0.1%?15%。
[0012]在步骤(I)中，各优选条件的效果为:水相溶液均一透明，浓稠度适合，使其能够完全分散于油相溶液，便于成球。
[0013]优选地，步骤(2)中，所述无毒高密度油为矿物油或植物油；
作为优选，所述无毒高密度油为液体石蜡、机油、汽油、硅油、花生油、玉米油或大豆油； 作为优选，所述水相和油相的体积比为1:1?10;
作为优选，所述的乳化剂和分散剂为Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或者任意两者的组合；
作为优选，所述油相中乳化剂和分散剂的体积浓度为0.1%?5%。
[0014]在步骤(2)中，各优选条件的效果为:油乳液均一稳定，能够使淀粉水相溶液稳定分散于油相溶液中，乳化成球。
[0015]优选地，步骤(3)中，所述的交联剂为戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、氮丙啶中的一种；
作为优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的3%?20% ；
作为进一步优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的8%?12% ；
作为优选，所述的交联搅拌速度为200?lOOOrpm，反应时间为2?10小时；
作为进一步优选，所述的交联搅拌速度为400?700rpm，反应时间为4?8小时。
[0016]在步骤(3)中，各优选条件的效果为:交联剂与水相溶液完全反应，固化效果好，微球刚性及耐压程度高，并且该搅拌速度条件下，成球的粒径90%以上都在100?300μπι，可应用于微载培养；
优选地，步骤(4)中，所述的表面活性剂的质量浓度为I?5%;
作为优选，所述表面活性剂为 Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、TRIT0N-100 或OP-1O中的一种。
[0017]在步骤(4)中，各优选条件的效果为:表面活性剂具有特有的界面活性，使疏水基和亲水基之间有一定的平衡，同时附降低水的表面张力，辅助乳化作用，使水相溶液能够完全乳化，形成均一稳定的乳化液。当表面活性剂选择以上几种中的一种时，乳化效果最佳。
[0018]优选地，步骤(5)中，所述的湿微球的质量、NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积三者之间的比值为1:1?4:1?4;
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5?4mo I /L，DEAE-HCl的浓度为I?5 mo I /L;
作为优选，所述偶联反应的速度为400?800rpm，偶联温度60?80 °C，交联时间为2?6小时。
[0019]在步骤(5)所述条件下，淀粉微球表面活性羟基都能与DEAE发生偶联反应，DEAE可以完全均与偶联在淀粉微球表面，而且偶联的DEAE浓度不会太高或者太低，便于细胞贴附在微载体表面正常生长。
[0020]优选地，所述步骤(6)后还将得到的微载体筛分的步骤，取粒径在100?400μπι的微载体；
作为优选，取粒径在200?300μπι的微载体；
作为进一步优选，在筛分后还包括灭菌的步骤;所述灭菌是将微载体洗净之后，用高压蒸汽灭菌或用75%酒精浸泡灭菌，或