一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]细胞替代治疗是重建受损神经系统的组织结构、恢复神经系统功能的一种有效策略。在细胞替代疗法中，最关键的两个问题是种子细胞的来源和种子细胞在体内的存活率。虽然干细胞作为种子细胞具有巨大的应用潜能，但其中多种干细胞却涉及诸多问题而无法应用于临床，例如，人类胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)虽然具有诱导成为神经细胞的潜能，但因涉及到伦理道德、致瘤性及免疫排斥等问题，无法作为种子细胞用于临床治疗；由人类成纤维细胞诱导成的全能性干细胞(human Fibroblast InducedPluripotent Stem Cells，iPSCs)虽然避免了伦理和免疫排斥问题，但是由于该技术带来的病毒随机整合造成的致瘤性和其它迄今无法预知的生物安全问题成为了 iPSCs用于临床治疗的阻碍。
[0003]为克服hESCs和iPSCs的上述种种不足，有科学家提出了将组织干细胞用于临床治疗。组织干细胞，也被称为成体干细胞(Adult/Tissue Stem Cells，ASC)，是近来发现的一群存在于人体各组织器官内的具有多项分化潜能的干细胞。现阶段研究较为广泛的组织干细胞有间充质干细胞(Adult Mesenchymal Stromal Cells，MSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone-Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells ,BMSCs) dMSCs可塑性较强，在临床应用方面研究广泛，已成为备受瞩目的种子细胞。BMSCs用于临床治疗白血病已显示出良好的效果，但由于BMSCs取材不易，且取材过程中给病人带来的痛苦较大，获得的材料中干细胞含量少，体外培养扩增速率慢且老化率高，因此，其临床应用研究并不顺利。最近的研究发现，脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose-derived Stem cells,ADSCs)，易于取材(只需通过负压真空抽脂)，给病人造成的痛苦较小，获得的脂肪组织中干细胞含量高，体外易于培养和传代，具有多方向的分化潜能(如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞β等)，已成为细胞治疗的研究热点。
[0004]将脂肪干细胞定向分化为特定类型和功能的神经元，是实现脂肪干细胞用于临床治疗相应退行性神经性疾病的关键，在临床治疗退行性神经性疾病方面也拥有巨大的应用前景，但是，目前国内外对于脂肪干细胞定向分化为特定类型和功能的神经元的研究很少，对于脂肪干细胞向特定神经元细胞(例如运动神经元)分化的分子机理基础以及诱导剂如何介导该特定分化过程的生物学信号通路(例如SHH、TGF_i3等)等并不清楚，导致转分化的特异性和效率不高，而转分化的效率和分化得到的运动神经元的功能性和特异性的不理想，极大的阻碍了脂肪干细胞在临床上的应用。鉴于此，目前亟待提出一种可实现将脂肪干细胞定向分化为功能性运动神经元细胞、高效的制备脂肪干细胞来源的神经元细胞的方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是现有技术中对于脂肪干细胞的定向转分化效率较低、分化得到的运动神经元的功能性和特异性不理想的问题，进而提供一种可实现将脂肪干细胞定向分化为功能性运动神经元细胞、高效的制备脂肪干细胞来源的神经元细胞的方法。
[0006]本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0007](I)将人源脂肪干细胞体外分离、培养、鉴定；
[0008](2)将步骤I)中得到的所述人源脂肪干细胞，采用SHH和RA共同诱导分化为运动神经元细胞；
[0009](3)将步骤2)中得到的所述运动神经元细胞体外培养，使其成长为成熟的具有电生理功能的功能性运动神经元细胞。
[00?0] 需要说明的是，所述SHH是指Sonic Hedgehog;所述RA是指Retinoicacid;所述人源脂肪干细胞(简称为hADSCs)，可以通过从人体外科手术或者整形抽脂术获得的脂肪组织中分离得到。
[0011]优选地，所述步骤(I)为:采用贴壁培养的方法从脂肪组织中分离筛选所述人源脂肪干细胞，从细胞的梭形形态和细胞表面标记表征分离获得的所述人源脂肪干细胞，并用RT-PCR对分离获得的所述人源脂肪干细胞进行鉴定;其中，所述细胞表面标记为CD免疫表面标记;所述RT-PCR鉴定所述人源脂肪干细胞的通用标记包括Sox2、0ct4、c-Myc、Nanog、KLF4中的一种或多种。
[0012]进一步优选地，所述贴壁培养的方法具体包括以下步骤:
[0013]将脂肪组织置于0.075%的I型胶原酶中，在37°C的温度下消化，并在消化过程中每隔5分钟摇动一次，40分钟后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培养基中和胶原酶，然后在1500rpm/min的转速下离心10分钟，弃掉上层油脂和上清，用含血清的培养基悬浮离心管底部的细胞团，并使其通过70um的细胞过滤器以去掉组织碎片；
[0014]将上述收获的细胞滤液铺到1cm的培养皿中，置于37°C下，在含5%⑶2湿度饱和的培养箱中培养24小时后，换液并用PBS冲洗，加入新鲜的培液继续培养；
[0015]每3-4.5天换液一次，直至脂肪干细胞铺满皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化处理传代。
[0016]需要说明的是，本发明中所述的0.075%的I型胶原酶、10%血清等所有涉及百分比的溶液均指质量百分比。
[0017]优选地，所述步骤(2)还包括采用特异神经细胞标记蛋白表征获得的所述运动神经元细胞的步骤;所述特异神经细胞标记蛋白为HB9或01 igo2中的一种或两种。
[0018]进一步优选地，所述步骤(2)还包括利用电生理功能鉴定获得的所述运动神经元细胞的步骤。
[0019]优选地，所述步骤(3)具体为:将步骤2)中得到的所述运动神经元细胞与原代神经细胞及神经营养因子共体外培养，使其成长为成熟的具有电生理功能的功能性运动神经
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[0020]进一步优选地，所述神经营养因子为BDNF、GDNF、IGF中的一种或多种。[0021 ] 对所述运动神经元细胞进行体外培养时，还用电生理检测各个阶段运动神经元的电生理活性及与原代神经细胞建立联系的状况。
[0022]本发明还提供了采用上述制备方法得到的功能性运动神经元细胞。
[0023]本发明所述的功能性运动神经元细胞在制备治疗运动神经元损伤或退行性疾病的药物领域的应用；优选地，本发明所述的功能性运动神经元细胞在制备治疗脊髓损伤的药物领域的应用。
[0024]本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点:
[0025](I)人源脂肪干细胞本身具有因取材容易、具有神经等多向分化潜能、体外分离培养简单且获得的干细胞数量多、传代培养较骨髓间充质干细胞老化率低等优势，而本发明采用SHH和RA诱导hADSCS体外分化为运动神经元，并研究调控分化的信号通路如SHH、TGF-13等，深入揭示调控脂肪干细胞向运动神经元分化的分子机理和调控该分化过程中的信号通路，实现了简单易行、分化得率高的神经元细胞的制备，提高了脂肪干细胞向运动神经元定向分化的转分化效率和特异性；
[0026](2)本发明通过追踪脂肪干细胞及其分化获得的细胞在脊髓损伤动物模型中的去向和分化状况，得出了所述的功能性运动神经元细胞治疗运动神经元损伤或退行性疾病的领域具有良好的疗效。
【附图说明】
[0027]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
[0028]图1A为实施例4中以Sox2、0ct4、c_Myc、Nanog、KLF4作为干细胞标记物在400X的显微镜下的分子图；
[0029]图1B为经过三次独立实验得到的干细胞标志物阳性率平均值；
[0030]图1C为以Sox2、0ct4、c_Myc和Nanog为干细胞标志物对P3hADSCs进行RT-PCR检测的结果图；
[0031 ]图2为实施例4中采用Tujl和NeuN进行免疫标记得到的免疫染色图；
[0032]图3为实施例4中检测到表达MAP2和HB9的运动神经元的免疫染色图；
[0033]图4为实验例中小鼠的冷冻切片的免疫染色检测图。
【具体实施方式】
[0034]实施例1
[0035]本实施例的人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0036](I)将人源脂肪干细胞体外分离、培养、鉴定:采用贴壁培养的方法从脂肪组织中分离筛选所述人源脂肪干细胞，从细胞的梭形形态和细胞表面标记表征分离获得的所述人源脂肪干细胞，并用RT-PCR对分离获得的所述人源脂肪干细胞进行鉴定；
[0037]其中，所述细胞表面标记为⑶免疫表面标记;所述RT-PCR鉴定所述人源脂肪干细胞的通用标记为5(?2、0(^4、(3-]%(3、他1108、1(1^40
[0038](2)将步骤I)中得到的所述人源脂肪干细胞，采用SHH和RA共同诱导分化为运动神经元细胞；
[0039](3)将步骤2)中得到的所述运动神经元细胞体外培养，使其成长为成熟的具有电生理功能的功能性运动神经元细胞。
[0040]实施例2
[0041]本实施例的人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0042](I)将人源脂肪干细胞体外分离、培养、鉴定:
[0043]将脂肪组织置于0.075%的I型胶原酶中，在37°C的温度下消化，并在消化过程中每隔5分钟摇动一次，40分钟后用含10%血清、1%P/S的DMEM/F12培养基中和胶原酶，然后在1500rpm/min的转速下离心10分钟，弃掉上层油脂和上清，用含血清的培养基悬浮离心管底部的细胞团，并使其通过70um的细胞过滤器以去掉组织碎片；
[0044]将上述收获的细胞滤液铺到1cm的培养皿中，置于37°C下，在含5%⑶2湿度饱和的培养箱中培养24小时后，换液并用PBS冲洗，加入新鲜的培液继续培养；
[0045]每3-4.5天换液一次，直至脂肪干细胞铺满皿底90 %后，用0.025 %胰蛋白酶消化处理传代；
[0046]从细胞的梭形形态和细胞表面标记表征分离获得的所述人源脂肪干细胞，并用RT-PCR对分离获得的所述人源脂肪干细胞进行鉴定;其中，所述细胞表面标记为CD免疫表面标记；所述RT-PCR鉴定所述人源脂肪干细胞的通用标记为Sox2、Oc t4、c-Myc、Nanog、KLF4o
[0047](2)将步骤I)中得到的所述人源脂肪干细胞，采用SHH和RA共同诱导分化为运动神经元细胞，用特异神经细胞标记蛋白表征获得的所述运动神经元细胞;所述特异神经细胞标记蛋白为HB9和01igo2。
[0048](3)将步骤2)中得到的所述运动神经元细胞体外培养