一种修饰的增强型dc-cik靶向免疫细胞群的制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及修饰的DC-CIK细胞靶向性免疫 细胞群及其制备方法和用途，属于细胞生物学、免疫学、肿瘤治疗领域。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，成为威胁人类健康的头号杀手。卫生部 最新统计数据，据2012年癌症有关报告显示，我国每年新发癌症病例约337万，死亡约211 万。癌症已成为我国死亡第一大原因，死亡人数占全球癌症死亡人数四分之一。2012年世界 癌症报告显示，每年癌症新发病例约1400万，死亡约800万，这与2008年的统计结果1270万 人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到 820万人。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。我国新发病例占 全球新发病例22%，死亡人数占26%，超过全球癌症死亡人数的四分之一。男性当中肺癌发病 率最尚，女性是乳腺癌。
[0003] 目前的肿瘤临床治疗策略中，主要以手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤进行治 疗，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗法进行系统性治 疗。但治疗效果多半不理想，并常伴有严重的副作用。肿瘤的发生是多步骤、多基因突变作 用的结果，表现出生长、分化与凋亡的失控。临床上病人的诊断具有多样性和个体遗传异质 性，同时经常办随肿瘤远处转移病灶的出现和复发，使肿瘤治疗必须以全身性疾病的观点， 采取全身治疗方案，不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤对 重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。
[0004] 近年来，随着分子医药技术的发展，肿瘤免疫疗法治疗肿瘤成为肿瘤临床治疗的 焦点，为肿瘤患者带来了希望。2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破的首 位，细胞免疫治疗方法在理论上有巨大优势：（1)它不损伤降低免疫系统功能，反而增强免 疫系统。对活跃繁殖和静止隐藏的癌细胞都有杀伤效果。（2)可以广谱治疗多种癌症，对普 遍人群均有效果。（3)可以通过治疗后的免疫监视抑制癌细胞进化，降低复发率。由于肿瘤 细胞免疫治疗应用范围广（可用于多种实体肿瘤及白血病），特别对肿瘤微小病灶（包括 转移、复发灶、血液中的癌细胞）更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段（如晚期 放、化疗不易使用），因此具有巨大的应用前景和广阔的市场空间。
[0005] 细胞免疫治疗主要包括CIK和DC细胞： 树突状细胞(Dendritic cell，DC)是近年来所发现的最为重要的免疫调控和辅助细 胞，它是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原并向T淋巴细胞提呈抗原分子的 功能，并表达共刺激分子和粘附分子;且能分泌在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用的Thl型 细胞因子IL-12,诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞，认别和杀伤肿瘤细胞。
[0006] 多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell，CIK)是将人外 周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养 一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故 又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性 杀瘤优点。因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细 胞中的效应细胞⑶3+和⑶56+细胞在正常人外周血中较少，仅1%-5%。
[0007] 人们又发现当在CIK细胞培养时加入肿瘤患者自体的DC后，彼此能相互作用，促进 双方细胞的成熟，并诱导除比同源CIK细胞更强增殖活性和更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞 群。本发明在对DC细胞和CIK细胞增殖、杀伤特性研究的基础上，对CIK细胞进行早期修饰， 并把DC与CIK进行共培养，可产生明显增强的CIK细胞群，其增殖效率和抑瘤细胞活性均有 显著增强。
[0008] 程序性死亡受体-l(programmed death 1，Ρ?-1)Η)-1是免疫球蛋白超家族I型跨 膜糖蛋白，相对分子质量为55Χ103左右，由细胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区组成。PD-1 分子最显著的特征是细胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基，分别参与组成免疫受体酪氨 酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ΙΤΙΜ)和免疫受体酪 氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based swith motifs，ITSM)结构域dITIM能使 细胞质段的磷酸化得到恢复，发挥拮抗抗原受体的功能，而itsm上的酪氨酸残基在ro-i的 负性调节中是必需的。PD-1配体包括ro-Ll和ro-L2,其中ro-Li广泛表达在τ细胞、b细 胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多种肿瘤细胞及一些非淋巴ro-1 /PD-Ls发挥着负 性免疫调节作用。当细胞表面的PD-1与PD-Ls耦联后，可导致T细胞胞质区的ITSM结构域 的Tyr磷酸化，然后磷酸化的Tyr即可募集磷酸酶蛋白酪氨酸酶-2和蛋白酪氨酸酶-1， 不仅可阻滞细胞外信号调节激酶的活化，还可阻断磷脂酰肌醇3 -激酶 (phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine /threonine kinase，Akt)的激活，最终抑制T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的分泌。
[0009] 因此本研究通过在CIK细胞表面过量表达无胞内功能区的PD-1，使之成为肿瘤表 面ro-Ll的假受体，从而减少CIK细胞表面具有胞内功能区的PD-1与肿瘤细胞表面的ro-Ll 结合，减少肿瘤对杀伤性细胞的抑制，极大的增强肿瘤杀伤效果。
【发明内容】
[0010] 本发明公开了一种修饰的DC-CIK细胞靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途， 其制备方法如下： 1.制备表达人源ro-i片段慢病毒 合成序列表的SEQ ID NO: 1所示的双链DNA分子，将其连入商业化慢病毒载体中，以 pWPXL载体系统作为示范例，包括但不限于pWPXL载体，构建出重组质粒pWPXL-PD-Ι。通过下 列常规操作完成病毒包装： a、采用磷酸钙法将重组表达质粒连同辅助质粒共转染HEK293细胞。接种HEK293细胞于 含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 °C和5% C02的条件下培养至对数生长期，收集细胞， 于10 cm直径的细胞培养皿中接种5 X106个细胞，继续培养16~24 h。待细胞长至70~80% 密度时更换培养基为MDM，孵育2~4 h后进行病毒转染。
[0011] b、将重组质粒pWPXL-PD-l和包装质粒pMD2.G质粒和psPAX2质粒共转染HEK293细 胞(每1 X 106个细胞约转染30-40yg重组质粒，转染过程为将包装质粒与磷酸钙溶液过滤混 合后，加到培养皿中，混匀。8-15 h后，将培养基换成DMEM，48~60 h后，收集上清。
[0012] 所用质粒量如下表： 2.病毒纯化
采用超速离心纯化方法，步骤如下：1、将收集的培养液离心，4 °C，3000rpm，20min; 2、 吸取上清，过滤膜(〇. 45um) ; 3、4 °C离心，2000rcf，2小时;4、弃上清，加入1/1000体积的预冷 的PBS，振摇溶解;5、4 °C离心，lOOOrpm，lOmin; 6、吸取上清，10ul/支分装，冻存在-80 °C; 病毒滴度测定:ELISA法测定全病毒病毒滴度:抗原检测操作按试剂盒说明书进行。
[0013] 对照病毒的制备 用pWPXL质粒代替重组质粒pWPXL-PD-1进行步骤二、三，得到的溶液命名为pWPXL病毒 液。
[0014] 修饰的 DC-CIK(Platinum-DC-CIK)的制备 a. 外周血单个核细胞PBMC的制备 取新鲜抗凝全血，EDTA(枸橼酸钠或肝素)抗凝剂均可。用等体积PBS或0.9%NaCl稀 释全血。在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持 两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、PBS(或生理盐水）体积为1:1: 1。，离心 2000rpml25min，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液 VIV0-15调节细胞密度使成5ll06/ml细胞悬液； b. 非粘附与粘附细胞分尚 将细胞悬液移入6孔板，37°C，5%C02，培养2h，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非粘附细 胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔 待用。
[0015] C.粘附DC细胞的诱导和扩增 在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加 DC培养液3ml内含有GM-CSF800U/ml和IL-4