小鼠nrdp1基因定点修饰系统及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种小鼠 NRDP1基因定点修饰系统及其 应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途 径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径，主要降解通过摄粒作用或胞饮作用 进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质 降解途径，被降解的蛋白通过￡1(泛素激活酶，1]1^911；[1：；[11-301：；^31：；[1^61^71116)42(泛素偶 联酶，Ubi quit in-con jungating enzyme)和 E3(泛素连接酶，Ubi quit in ligase)-系列的 作用与多个泛素共价结合后被蛋白酶复合体(Proteasome)识别并降解。此为生物大分子在 胞质中降解的泛素-蛋白酶体途径(ubiquitim proteosome pathway)。该途径广泛参与到 细胞周期、炎症反应、细胞凋亡、抗原提呈等许多生命过程中。
[0003] Nrdpl(neuregulin receptor degradation protein-l)是一种E3泛素连接酶。 Nrdpl能双向调节TLR介导的两条信号通路(降解MyD88抗炎，激活TRIF和TBK1促生干扰素）， 最终介导抗炎和抗病毒的双重效应。过表达Nrdpl可以抑制脂多糖(LPS)诱导的炎性因子 IL-6和TNFa的mRNA和蛋白的表达，但是可以促进I型干扰素（IFN-β)的产生;干扰Nrdp 1则促 进了炎性细胞因子的产生，但是抑制了 IFN-β的产生。进一步发现Nrdpl可以促进MyD88和 TBK1分子的泛素化，诱导MyD88的降解，但是促进TBK1的活化，从而抑制MyD88依赖的NF-kB 的活化，引起炎性细胞因子的产生减少；同时促进IRF3的磷酸化，增加 I型IFN的产生。进一 步的验证表明，Nrdpl和E3泛素酶活性缺失的转基因小鼠的巨噬细胞受到TLR配体刺激后， 促进MyD88依赖的前炎性因子的产生，但抑制TRIF依赖的IFN-β的产生。因此，Nrdpl在TLR的 信号传导过程中发挥一双向II调节机制，一方面通过降解MyD88抑制TLR诱导的炎症因子的 产生，另一方面通过促进TBK1-IRF3的活化促进I型干扰素的产生，为TLR的分子调节机制研 究提供了新的思路。因此，Nrdpl是一个可能在各种病原体感染的治疗中均具有潜在应用价 值的药物靶标，在抗炎和抗病毒感染方面前景广阔。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种小鼠 NRDP1基因定点修饰系统，以实现对小鼠 NRDP1基 因的定点修饰。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述小鼠 NRDP1基因定点修饰系统在哺乳动物细胞或 胚胎NRDP1基因修饰中的应用。
[0006] 本发明的还一目的在于提供一种NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式首先提供了一种小鼠 NRDP1基因定点修 饰系统，该基因定点修饰系统为剪切小鼠 NRDP1基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶 TALENs。其中，上述小鼠 NRDP1基因靶序列如SEQ ID N0.1所示，具体来说，在SEQ ID N0.1序 列中：20~40位核苷酸为识别模块TALNRD-2F、与57~74位核苷酸的互补序列为识别模块 TALNRD-2R、40~56核苷酸为间隔序列。上述转录激活样效应因子核酸酶TALENs由识别上述 识别模块TALNRD-2F的核酸酶TALEN-L和识别上述识别模块TALNRD-2R的核酸酶TALEN-R组 成 ;核酸酶TALEN-L为SEQIDN0.2所示核苷酸序列编码的蛋白质，核酸酶TALEN-R为SEQID NO.3所示核苷酸序列编码的蛋白质。
[0008] 进一步地，在本发明的实施方式所提供的小鼠 NRDP1基因定点修饰系统中，核酸酶 TALEN-L由所述识别模块TALNRD-2F的识别结构域TALEN-L与经过人工改造的DNA切割蛋白 Fok-I融合而成;所述核酸酶TALEN-R由所述识别模块TALNRD-2R的识别结构域TALEN-R与经 过人工改造的DNA切割蛋白Fok-I融合而成。
[0009] 本发明的实施方式还提供上述小鼠 NRDP1基因定点修饰系统在哺乳动物细胞或胚 胎NRDP 1基因修饰中的应用。
[0010] 具体来说，本发明的实施方式所提供的上述小鼠 NRDP1基因定点修饰系统在哺乳 动物细胞或胚胎NRDP 1基因修饰中的应用，是指建立NRDP 1基因敲除小鼠模型。
[0011] 本发明的实施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，包括下述步骤： (1)根据如SEQIDN0.1所示的小鼠 NRDP1基因靶序列，构建具有SEQIDN0.2所示核苷酸序 列的pTALEN-L质粒和SEQIDN0.3所示核苷酸序列的pTALEN-R质粒；（2)通过体外转录获得 以所述PTALNRD-L质粒和pTALNDR-R质粒为模板的mRNA混合物，显微注射至小鼠胚胎的卵周 隙中；（3)将步骤(2)得到的小鼠胚胎移植到受体小鼠子宫，产仔获得NRDP 1基因修饰的小 鼠；（4)使步骤(3)得到的NRDP1基因修饰的小鼠与野生型小鼠交配，得到的仔鼠经过PCR和 Western-Blotting测得到敲除杂合子个体，杂合子间交配得到纯合子小鼠，即完成NRDP1基 因敲除小鼠模型的建立。
[0012] 进一步地，本发明的实施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法中，还包 括对步骤（1)中得到的pTALNRD-L质粒和pTALNDR-R质粒进行活性检测的步骤，选择对小鼠 NRDP1基因具有修饰活性的pTALNRD-L质粒和pTALNDR-R质粒为模板进行所述步骤(2)中的 体外转录。具体来说，述对步骤（1)中得到的pTALNRD-L质粒和pTALNDR-R质粒进行活性检 测的步骤为：将所述pTALEN-L质粒和pTALEN-R质粒共转染至小鼠细胞中，PCR扩增目的基 因，通过测序鉴定目的基因是否发生突变。
[0013] 进一步地，本发明的实施方式也提供NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法中，步骤 (4)之后还包括对所述NRDP1基因敲除小鼠模型进行鉴定分析的步骤。具体来说，上述对 NRDP1基因敲除小鼠模型进行鉴定分析的步骤为：（1)对NRDP1靶位点进行DNA测序，鉴定小 鼠动物模型的基因型；（2)通过Western-Blotting检测小鼠各组织器官NRDP1蛋白的缺失； (3) 利用Western-Blotting监测因为NRDP1蛋白缺失而引起各个信号通路蛋白表达的改变； (4) 观察小鼠各组织器官或组织是否因为NRDP1蛋白缺失而发生病变。
[0014]此外，本发明的实施方式也提供上述小鼠 NRDP 1基因定点修饰系统编码基因的重 组表达载体、重组菌或重组细胞系。
[0015]综上，本发明涉及的NRDP 1基因敲除小鼠模型的制备方法，其是根据小鼠 NRDP1基 因序列，设计能够有效识别、修饰小鼠 NRDP1基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶 TALENs，构建表达载体并通过体外转录获得靶向NRDP1基因的mRNA混合物，将其注射至小鼠 胚胎并回移至受体母鼠获得NRDP1基因修饰的小鼠。本发明利用TALENs介导的基因敲除技 术，设计合成了可特异识别并修饰小鼠 NRDP1基因的一对TALENs，并通过体外转录mRNA注射 小鼠胚胎，一步法获得了NRDP1双等位基因敲除的转基因小鼠。试验周期短，高效且节省成 本。本发明制备的NRDP1基因敲除小鼠模型，不仅可以加深对NRDP1在免疫系统疾病发病过 程中基因调控的认识，而且可以为转化医学和新药研发提供高水平的试验动物模型。
【附图说明】
[0016] 图1为TALENs定点修饰小鼠 NRDP1基因的作用原理示意图；
[0017] 图2为TLANEs体外转录mRNA产物电泳图；
[0018] 图3为NRDP1基因敲除小鼠 F0代S84小鼠的基因测序峰图；
[0019] 图4为NRDP1基因敲除小鼠 F0代S86小鼠的基因测序峰图；
[0020] 图5为NRDP1基因敲除小鼠 F0代s87小鼠的基因测序峰图；
[0021] 图6为NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl68小鼠的基因测序峰图；
[0022] 图7为NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl68小鼠的基因测序峰图；
[0023] 图8为NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl70小鼠的基因测序峰图；
[0024] 图9为NRDP1基因敲除小鼠 F0代sl73小鼠的基因测序峰图；
[0025]图10为NRDP1基因敲除小鼠 F3代部分纯合子小鼠 PCR检测结果电泳图；
[0026]图11为样品编号为55的NRDP 1基因敲除小鼠 F3代部分纯合子小鼠的基因测序峰 图；
[0027]图12为样品编号为58的NRDP1基因敲除小鼠 F3代部分纯合子小鼠的基因测序峰 图。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。
[0029] NRDP1基因与机体抗炎和抗病毒有关，可能是各种病原体感染的治疗中均具有潜 在应用价值的药物靶标。本实施例应用TALENs技术，针对小鼠 NRDP 1基因 exon 1的AGCT位点 进行密码子突变操作，从而实现小鼠 NRDP1基因的修饰。
[0030]实验方案涉及如下：
[0031 ]第一步，根据需敲除的基因序列设计出具有特异性的序列TALEN革巴点；
[0032] 第二步，根据设计出的TALEN祀点构建出TALEN质粒；
[0033]第三步，TALEs质粒修饰目的基因的效率的检测；
[0034] 第四步，体外转录获得高效修饰目的基因的TA