从乳腺癌石蜡包埋组织中提取dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA提取方法，特别涉及一种从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] 福尔马林固定石蜡包埋组织作为一种最为方便的临床材料来源，常被用于大宗病 例的回顾性研究。近年，随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标记物的出现，以石 蜡组织切片为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手 段。对于各种基因分析方法而言，重要的是首先获得足够纯度和数量的DNA。传统的酚/氯 仿抽提法是最早从乳腺癌石蜡包埋组织中纯化DNA的方法，虽可满足PCR等分析要求，但其 所用试剂毒性强、操作步骤复杂、样品损失量大，交叉污染也随之增多，不适合大量临床标 本特别是常规检测的需要。目前已发展了多种改良方法以简化操作步骤，包括一些商品化 的试剂盒，但仍然存在不同程度的缺陷。为此，本研究提出一种从乳腺癌石蜡切片中快速提 取DNA的方法，只通过较少的步骤即可获得足够纯度和数量的DNA，可有效用于PCR扩增和 DNA测序。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种安全、简易、快速和高效的、并 适于普通实验室应用和工业化生产的从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法。
[0004] 本发明的技术方案概述如下：
[0005] 从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为5-10 μ m的组织片，取3片组织片 置于无菌的1. 5ml离心管内，加入125-250 μ L pH为8. 0-8. 5的提取缓冲液，用胶带密封 后，置于微波炉中高火加热l_2min，取出后迅速离心，离心速度为14000-20000r/min，离心 时间为8-12min，取出置-20°C条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上 层蜡片充分硬化，倾斜离心管，用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品 A ；
[0007] (2)消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管，加入占样品A1倍体积的 裂解缓冲液，56-60°C水浴恒定温加热30min-3h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白 酶K溶液5-10 μ L，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8-15min灭活蛋白酶K，然后离 心，离心速度为14000-20000r/min，离心时间为8_12min，得上清液B ;
[0008] (3)沉淀：将步骤②所得的上清液B转移到另一 Eppendorf管，加入1/10体积的 3mo 1/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇，混匀，-20°C放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀， 用玻棒捞出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将 分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0009] 优选的，所述的提取缓冲液 pH 为 8. 0-8. 5,由 50mmol/LTris-HCL，lmmol/LEDTA， 0· 5% Tween-20 组成，体积比为 5:1:0. 8。
[0010] 优选的，所述的裂解缓冲液pH为 8. 0-8. 5,由 10mmol/LTris-HCL，0. 5% Tween-20， 450g/mL蛋白酶K组成，体积比为100:200:1。
[0011] 优选的，所述的ΤΕ缓冲液pH为8. 0-8. 5,由10mM Tris碱，ImM EDTA组成，体积比 为 5:1。
[0012] 优选的，所述的石蜡包埋组织切片标本储存时间为24小时-10年。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 实验证明本发明的方法分离提取步骤短，能够高效剥离乳腺癌组织中的DNA上的 蛋白质以及RNA物质，获得较长片段DNA产品，避免了现有技术存在难以提取乳腺等患恶性 肿瘤软组织中DNA的问题；
[0015] 本发明所用试剂为低毒化合物，对环境和人体的危害小；由于不易被分解，所获得 的产品可方便于远途运输和室温存贮；
[0016] 本发明可以从存档病理蜡块中提取出高质量的DNA，进行肿瘤分子生物学的相关 研究，使DNA研究不再依赖于新鲜或冰冻的组织，这在临床诊断、鉴别诊断和评估患者预后 等方面均具有重要价值；
[0017] 本发明操作简便、操作人员不需专业的技术便可操作，设备简单、成本低廉，所得 到的DNA得率和纯度都极高；
[0018] 本发明经过消化处理的DNA可直接用于PCR扩增和测序；
[0019] 该发明适于普通实验室应用和工业化生产。
【附图说明】
[0020] 图1DNA提取方法提取后的基因组DNA在1%脂糖凝胶电泳中的电泳图，得到分子 量在2000kb以上的基因组DNA。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面的实施例可以使本领域的技术人员能够理解本发明，但并不对本发明做任何 限制。
[0022] 实施例1
[0023] 一种从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
[0024] 第一步：取样，样品储存时间为24小时
[0025] 第二步：分离提取DNA
[0026] ①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为5 μ m的组织片，取3片组织片置于 无菌的1. 5ml离心管内，加入125 μ L pH为8. 0的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中 高火加热lmin，取出后迅速离心，离心速度为14000r/min，离心时间为8min，取出置-20°C 条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管， 用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A ;
[0027] ②消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管100 μ L，加入裂解缓冲液 100 μ L，56°C水浴恒定温加热30min，加热期间分次添加20mg/mL蛋白酶Κ溶液5 μ L，加热 期间摇床定时震荡30min/次，煮沸8min灭活蛋白酶Κ，然后离心，离心速度为14000r/min， 离心时间为8min，得上清液B ;
[0028] ③沉淀：将步骤②所得的上清液B200 μ L转移到另一 Eppendorf管，加入 20 μ L3mol/L醋酸钠和400 μ L冰冷无水乙醇，混匀，-20°C放置20分钟左右，DNA形成絮状 沉淀，用玻棒捞出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽干，将分离纯 化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0029] 其中提取缓冲液 pH 为 8. 0,由 50mmol/LTris-HCL 91. 9 μ L，lmmol/LEDTA18. 4 μ L， 0.5% Tween-2014.7yL 组成；裂解缓冲液 pH 为 8.0,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066yL，450g/mL 蛋白酶K lyL组成；TE 缓冲液pH为 8.0,由 10mmol/L Tris 碱 5mL, lmmol/L EDTA 组成 lmL〇
[0030] 实施例2
[0031] 一种从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
[0032] 第一步：取样，样品储存时间为10年
[0033] 第二步：分离提取DNA
[0034] ①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为10 μ m的组织片，取3片组织片置于 无菌的1. 5ml离心管内，加入250 μ L pH为8. 5的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中 高火加热2min，取出后迅速离心，离心速度为20000r/min，离心时间为12min，取出置-20°C 条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管， 用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A ;
[0035] ②消化和抽提：将步骤①所得样品中A转至新收集管100 μ L，加入裂解缓冲 液100μ L，60°C水浴恒定温加热3h，加热期间分次或一次性添加20mg/mL蛋白酶Κ溶液 10 μ L，加热期间摇床定时震荡30min/次，煮沸15min灭活蛋白酶K，然后离心，离心速度为 20000r/min，离心时间为12min，得上清液B ;
[0036] ③沉淀：将步骤②所得的上清液B200 μ L转移到另一 Eppendorf管，加入20 μ L的 3mol/L醋酸钠和400 μ L冰冷无水乙醇，混匀，-20°C放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀， 用玻棒捞出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将 分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0037] 其中提取缓冲液 pH 为 8. 5,由 50mmol/LTris-HCL 91. 9 μ L，lmmol/LEDTA18. 4 μ L， 0.5% Tween-2014.7yL 组成；裂解缓冲液 pH 为 8.5,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066yL，450g/mL 蛋白酶K lyL组成；TE 缓冲液pH为 8.5,由 10mmol/L Tris 碱 5mL, lmmol/L EDTA lmL 组成。
[0038] 实施例3
[0039] 一种从乳腺癌石蜡包埋组织中提取DNA的方法，包括如下步骤：
[0040] 第一步：取样，样品储存时间为8年
[0041] 第二步：分离提取DNA
[0042] ①脱蜡：将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为8 μ m的组织片，取3片组织片置于 无菌的1. 5ml离心管内，加入200 μ L pH为8. 3的提取缓冲液，用胶带密封后，置于微波炉中 高火加热lmin，取出后迅速离心，离心速度为16000r/min，离心时间为10min，取出置-20°C 条件下冷却直至水相和蜡层有机相出现分层，使离心管中上层蜡片充分硬化，倾斜离心管， 用灭菌注射器将底部含有DNA的组织混合溶液吸出，得样品A ;
[0043] ②消化和抽提：将步骤①所得样品中A100 μ L转至新收集管，加入裂解缓冲液 100 μ L，60°C水浴恒定温加热2h，加热期间分次添加20mg/mL蛋白酶K溶液8 μ L，加热期间 摇床定时震荡30min/次，煮沸lOmin灭活蛋白酶Κ，然后离心，离心速度为16000r/min，离 心时间为lOmin，得上清液B ;
[0044] ③沉淀：将步骤②所得的上清液B200 μ L转移到另一 Eppendorf管加入20 μ L的 3mol/L醋酸钠和400 μ L冰冷无水乙醇，混匀，-20°C放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀， 用玻棒捞出DNA沉淀，用70%冷乙醇洗DNA沉淀，三次，除去液体，真空抽或者室温干燥，将 分离纯化的DNA溶解于TE缓冲液，溶解后的DNA于4°C保存。
[0045] 其中提取缓冲液 pH 为 8. 3,由 50mmol/LTris-HCL 91. 9 μ L，lmmol/LEDTA18. 4 μ L， 0.5% Tween-2014.7yL 组成；裂解缓冲液 pH 为 8.3,由 10mmol/LTris-HCL33yL，0.5% Tween-2066yL，450g/mL 蛋白酶K lyL组成；TE 缓冲液pH为 8.3,由 10mmol/L Tris 碱 5mL, lmmol/L EDTA lmL 组成。
[0046] 实施例4