细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物核酸提取技术领域，具体涉及一种细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒以及使用该试剂盒提取细菌噬菌体基因组DNA的方法。
【背景技术】
[0002]B蜜菌体是一类以细菌为宿主的病毒。跟别的病毒一样，B蜜菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如:河水、泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。噬菌体被认为是地球上含量最为丰富的生物种类。
[0003]噬菌体只含有DNA或RNA中的一种遗传物质，绝大部分的噬菌体的遗传物质是DNA。近二十年来，随着分子生物学技术的进步，噬菌体的研究变得越来越热门，主要原因在于几个方面:第一，细菌的耐药问题日趋严重使曾经被寄予希望的噬菌体治疗再次进入研究者的视野;第二，微生物基因组测序技术的发展使人们发现细菌基因组中广泛存在着噬菌体的痕迹，显示出噬菌体在细菌基因组进化中扮演着非常重要的角色;第三，一些严重威胁人类健康的致病株的致病性都与前噬菌体有关;第四，噬菌体在细菌分型、检测、噬菌体展示、细菌重组工程、发展新的遗传学操作工具领域都有广泛的应用。
[0004]提取噬菌体基因组DNA是进行基于分子技术研究噬菌体的基础;此外在日益增加的噬菌体基因组测序要求中，最关键的一步也要求提取高质量、具有一定浓度并且不受宿主核酸污染基因组DNA，目前还没有可广泛使用的细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒，但是微生物领域却存在对细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒的强烈需求，通用的细菌噬菌体基因组DNA提取方法及试剂盒的出现必将大大减少技术人员的操作时间，加快相关领域的研究进程。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可以广泛使用的细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法，从而填补没有可广泛使用的噬菌体基因组DNA提取试剂盒及方法的技术空白。
[0006]本发明的细菌噬菌体基因组DNA提取试剂盒，包括以下试剂:
[0007](I)试剂A:氯仿；
[0008](2)试剂B:用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的DNase I，_20°C保存；
[0009](3)试剂C:用TE缓冲液配制的10-20mg/ml的RNase A，_20°C保存；
[0010](4)试剂D:为沉淀缓冲液，含300-400mg/ml的聚乙二醇-8000(PEG-8000)和3MNaCl，无菌水配制，室温保存；
[0011](5)试剂E:为裂解缓冲液，每升含有5.8g NaCl、1.23g MgSO4.7出0、50ml的IMpH8.(^9Tris-Cl(lM Tris，pH调整8.0)和 100ml 0.05mol EDTA，水为溶剂，高压灭菌20min;
[0012](6)试剂F:为主裂解液，150-200mg/ml的十二烷基苯磺酸钠(SDS)，水为溶剂；
[0013](7)试剂G:为副裂解液，用TE缓冲液配制的15-25mg/ml的蛋白酶K，4 °C保存；
[0014](8)试剂H:为杂质去除液，5-6M NaCl，溶剂为水；
[0015](9)试剂1:为DNA结合缓冲液，含6-7M异硫氰酸胍(GuSCN)和10mM Tris,pH 6.4；,溶剂为水；
[0016](10)试剂J:为漂洗缓冲液，由5-10mM pH 8.0的Tris-Cl与无水乙醇按1:4的体积比混合而成；
[0017](11)试剂K:为DNA洗脱液，5-1 OmM pH 8.0的Tris-Cl;
[0018]所述的TE缓冲液含有1mM三羟基甲基氨基四烷(Tris)和ImM乙二酸四乙酸(EDTA)，ρΗ 8.0ο
[0019]本发明的主要原理为:噬菌体裂解细菌后，释放到培养基中，以少量的试剂A(氯仿)杀死残存的细菌，并且可以促进培养基中脂质物质的分离；高速离心后，细菌细胞及细胞碎片沉淀，而噬菌体以及细菌自身的DNA和RNA仍然保留在培养液上清中；加入足量的试剂B (DNase I)和试剂C (RNase A)后，细菌自身的DNA和RNA受到降解破坏;试剂D中的NaCl、PEG-8000具有强烈的夺水能力，在高盐、高PEG-8000以及低温环境下，噬菌体粒子因夺水能力弱而逐渐沉降下来，再次离心去掉上清，沉淀的即为噬菌体粒子;噬菌体粒子的主要成分为蛋白和核酸，在试剂F (SDS)的作用下，噬菌体粒子的结构被破坏，在SDS以及试剂G (含蛋白酶K)的共同作用下，衣壳蛋白溶解，内部的基因组DNA释放出来;加入试剂H则提供了高浓度的NaCl环境，有利于残存的各种杂质沉淀。试剂I的主要成分为GuSCN，为一种高离液剂，试剂I提供一种高离液、低PH的环境，在这种环境下DNA可以与硅胶膜发特异性吸附，而杂质不能吸附，通过离心可以去除;在低浓度的缓冲液(如试剂I)或水中DNA又从硅胶膜释放，从而达到分离纯化目的。
[0020]因此，本发明还提供了细菌噬菌体基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0021]接种噬菌体裂解细菌后得到细菌的噬菌体裂解物，然后加入氯仿杀死残存的细菌和促进脂质物质的分离，再离心使细菌细胞和细胞碎片沉淀，取上清，在上清中加入DNaseI和RNase A，降解细菌本身的DNA和RNA，然后再加入含有聚乙二醇-800和NaCl的溶液，使噬菌体沉降，然后再离心去除上清，沉淀即为噬菌体粒子，然后再提取噬菌体的基因组DNA。
[0022]优选，具体方法如下:
[0023](I)细菌菌体及其碎片去除:细菌过夜培养后，按体积分数2 %接种于LB新鲜培养基，加入体积分数2 %的噬菌体液，37 °C振荡培养4-6小时，即获得细菌的噬菌体裂解物;取细菌的噬菌体裂解物10-201111，加入试剂4使其终浓度为体积分数1%，4°(:1000(^离心1min;
[0024](2)细菌核酸降解:小心取上清，用0.45μπι滤膜过滤，取滤液向其中加入10_20yL试剂B及10-20yL试剂C，混匀，37 °C温育30min;
[0025](3)细菌噬菌体粒子沉淀:加入5-10ml试剂D，轻柔上下混合，冰上放置60min以上或4°C过夜放置;1000g，4°C离心1min，小心弃去上清，得细菌噬菌体粒子沉淀；
[0026](4)细菌噬菌体衣壳蛋白结构破坏和水解:向细菌噬菌体粒子沉淀中依次加入250-500yL试剂E、50-100yL试剂F和1.5-3yL试剂G，50°C温育30min;
[0027](5)杂质去除:加入100-200yL试剂H，轻柔混匀4-6次，12000g离心lOmin，取上清；
[0028](6)DNA离液:加入步骤(5)所取上清二分之一体积的试剂I，上下轻轻颠倒混匀6_8次得混合液；
[0029](7)DNA吸附:将DNA吸附柱放置在离心管中，将上述步骤(6)中的混合液移入DNA吸附柱，12000g离心lmin，弃去过滤液；
[0030](8)吸附DNA清洗:向DNA吸附柱中加入600-700yL试剂J，12000g离心lmin，弃去过滤液;再次加入600-700yL试剂J，12000g离心Imin，弃去过滤液，将DNA吸附柱室温放置2-5min；
[0031](9)吸附DNA洗脱:将DNA吸附柱转移到一支新的离心管中，加入50-1 OOyL试剂K于DNA吸附柱的膜中央，室温放置l_2min; 12000g离心Imin，取洗脱液即得到细菌噬菌体基因组 DNA。
[0032]优选，所述的细菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体ΦΡΕ333、大肠杆菌噬菌体ΦΡ1655或阴沟肠杆菌噬菌体Φ PZJ02。
[0033]优选，所述的DNA吸附柱购自宁波重鼎生物技术有限公司。
[0034]本发明的优点及积极效果:(I)提取迅速，最快可以在2个小时内完成提取；(2)提取产量高，纯度高，提取基因组的DNA浓度达到10ngAiL以上，一次提取可满足PCR、基因组测序等分子实验需求；(3)提取产物不受宿主菌基因组DNA污染，因而根除了宿主基因组DNA的干扰。
【附图说明】
[0035]图1是实施例1-3中提取的三种噬菌体基因组DNA电泳图。图中:M，分子量MarkerA-Hind III digest； I，溶藻弧菌.菌体ΦΡΕ333;2，大肠杆菌.菌体ΦΡ1655;3，阴沟肠杆菌噬菌体(DPZJ02。
[0036]图2是对提取的噬菌体基因组DNA是否有宿主基因组DNA污染的PCR检测。图中:Μ，分子量Marker DL2000 ； I，溶藻弧菌基因组DNA阳性对照；2，噬菌体ΦPE333基因组DNA; 3，大肠杆菌基因组DNA阳性对照;4，噬菌体Φ P1655基因组DNA; 5，阴沟肠杆菌基因组DNA阳性对照;6，噬菌体Φ PZJ02基因组DNA;采用的靶基因为宿主菌保守看家基因gyrB，采用的扩增引物为gyrB扩增通用引物对gyrB-UF/gyrB_UR。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0038]下列实施例中未注明的具体实验条件和方法均为采用本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039]以下实施例中所采用的DNA吸附柱购自宁波重鼎生物技术有限公司。
[0040]实施例1:提取溶藻弧菌噬菌体ΦΡΕ333基因组DNA
[0041]按以下配方配制试剂:
[0042](I)试剂A:氯仿；
[0043](2)试剂B:用TE缓冲液配制的20mg/