拟茎点霉rpb2基因扩增引物及其设计方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明设计拟茎点霉真菌鉴别技术领域，具体的说，涉及拟茎点霉RPB2基因扩增 引物及其设计方法和应用。
【背景技术】
[0002]拟莖点霉属(Phomopsis(Sacc · )Bubak)是半知菌亚门（Deuteromycotina)、腔孢纲 (Coelomycetes)、球壳抱目（Sphaeropsidales)、球壳抱科（Sphaeropsidaceae)中的重要真 菌属，其有性态为间座壳属(Diaporthe)。该属真菌已描述900多种，呈世界性分布，主要集 中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业和林业上重要的病原菌，在我国2007年颁 布的进境植物检疫性有害生物名录中，其中包括6种检疫性拟茎点霉及其有形态真菌，分别 是黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides)、向日葵莖溃疡病菌（Diaporthe helianthi)、苹果果腐病菌(Diaporthe perniciosa)、大豆北方莖溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum Sacc . var. caulivora)、大豆南方莖溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum Sacc. var. meridionalis)、蓝莓果腐病菌（Diaporthe vaccinii)〇
[0003] RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymera-ses)在基因表达的过程中扮演着很重 要的角色。其中RNA聚合酶II由12个亚基组成(RTOl~RPB12)，负责转录生成hnRNA和mRNA。 RPB2(the second lar-gest RNA polymerase subunit)基因负责编码RNA聚合酶II的第2 大亚基，具有单拷贝和进化速率慢的特点。目前RPB2基因片段广泛用于构建系统发育树、预 测种群结构、评估种群进化过程、生态学研究以及确定分类地位等研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一对高效的拟茎点霉RPB2基因扩增引物。
[0005] 本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。
[0006] 本发明的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验 检疫中的应用。
[0007] 本发明设计的拟茎点霉RPB2基因扩增引物，其上游引物PR2-F有44个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
[0008] 本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引物设计的步骤为:登陆GenBank搜索目前已测 定全序列的60种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，并在5 '端加 入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物P R 2 - F有4 4个碱基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。扩增片断大小在 1000bp 左右。
[0009] 可扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系为25yL，内含2X Taq MasterMix、10yM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50 ~150ng的DNA模板溶液、ddH20。
[0010] 扩增体系：2X Taq MasterMix 12.5yL、PR2-F lyL、PR2-R lyL、Template lyL、 ddH20 9.5yL〇
[0011] 反应程序：94°C预变性3min，然后94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共35 个循环，最后在72°C充分延伸lOmin。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及 亮度。
[0012] 本发明所述的拟茎点霉RPB2基因增引物可扩增拟茎点霉RPB2基因片段，能获得单 一的目的片段，产物大小为lOOObp左右，并可对PCR扩增产物进行直接测序。其步骤为:PCR 扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/yL的样品委托公司进行双向直接测序，测序引物为 PR2-F(10yM)和PR2-R(10yM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引 物对我国常见拟茎点霉真菌RPB2基因进行扩增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增 产物大小为l〇〇〇bp左右，经测序及与GenBank上同源序列的比较，证实为拟茎点霉RPB2基 因的扩增产物。利用本发明设计的拟茎点霉RPB2基因扩增引物，可以对拟茎点霉属真菌进 行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国拟茎点霉种类鉴定、 地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。
【附图说明】
[0014] 图1为PR2-F/PR2-R扩增不同拟茎点霉RPB2基因的电泳图谱。
[0015] 其中M:DNA分子量标准（100bp DNA Ladder)，N:阴性对照，1 - 16:依次为大豆拟 莖点种腐病菌(Phomopsis longicolla)、黄瓜黑色根腐病菌(Phomopsis sclerotioides)、 小麦拟莖点霉（Phomopsis controversa)、茴香拟莖点霉（Phomopsis foeniculi)、十字花 拟莖点霉（Phomopsis cruciferae)、杏拟莖点霉（Phomopsis amygdali)、苘麻拟莖点霉 (Phomopsis abutilonis)、扁桃拟莖点霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯拟莖点霉 (Phomopsis fukushii)、芦舆拟莖点霉(Phomopsis asparagi)、粽竹拟莖点霉(Phomopsis rhapidis)、前褐纹拟莖点霉（Phomopsis vexans)、棒拟莖点霉(Phomopsis cinnamom)、蔓 绿绒拟莖点霉(Phomopsis philodendri)、花烛拟莖点霉(Phomopsis anthurii)、苹果拟莖 点菌（Phomopsis mali)〇
【具体实施方式】
[0016] 登陆GenBank搜索目前已测定序列的60种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分 的序列，寻找保守序列，并在5'端加入测序序列，从而获得一对通用引物:其上游引物PR2-F 有 44个碱基:CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R 有 46 个碱 基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
[0017]可扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系为25yL，内含2X Taq MasterMix、10yM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50 ~150ng 的DNA 模板溶液、ddH20。反应体系为：2X Taq MasterMix 12.5yL、PR2-F lyL、 PR2-R lyL、Template lyL、ddH20 9.5yL。扩增条件为：94°C预变性3min，然后94°C变性30s， 56°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后在72°C充分延伸10min。扩增产物用1%的琼 脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。
[0018]本发明所述的拟茎点霉RPB2基因增引物能扩增拟茎点霉属真菌RPB2基因，均能获 得单一的目的DNA片段，产物大小为lOOObp左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其 步骤为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/yL的样品委托公司进行双向直接测 序，测序引物为M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序 仪。
[0019] 本发明的拟茎点霉RPB2基因扩增引物对我国常见拟茎点霉真菌RPB2基因进行扩 增，均能获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为lOOObp左右，经测序及与GenBank 上同源序列的比较，证实为拟茎点霉RPB2基因的扩增产物。其主要扩增的拟茎点霉真菌包 括以下种类：大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis 1〇1^4〇11&)、黄瓜黑色根腐病菌 (Phomopsis sclerotioides)、小麦拟莖点霉（Phomopsis controversa)、茴香拟莖点霉 (Phomopsis foenicul i )、十字花拟莖点霉（Phomopsis cruciferae )、杏拟莖点霉 (Phomopsis amygdali)、苘麻拟莖点霉（Phomopsis abutilonis)、扁桃拟莖点霉 (Phomopsis amygdal iana)、梨干枯拟莖点霉（Phomopsis fukushi i )、芦舆拟莖点霉 (Phomopsis asparagi)、粽竹拟莖点霉（Phomopsis rhapidis)、前褐纹拟莖点霉 (Phomopsis vexans)、棒拟莖点霉（Phomopsis cinnamom)、蔓绿绒拟莖点霉（Phomopsis philodendri)、花烛拟莖点霉(Phomopsis anthurii)、苹果拟莖点菌(Phomopsis mali)。其 电泳图谱如图1所示，从而可对拟茎点霉真菌进行分析鉴别。
【主权项】
1. 拟茎点霉RPB2基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在一起，其上游 引物 PR2-F 有44个碱基:CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R 有 46 个碱基:AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。2. 权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征包括如下步骤:找出已测定全序列的60 种拟茎点霉RPB2基因，去掉不完全和部分序列，进行同源性比较，寻找保守序列，并在5'端 加入测序序列，从而获得一对通用引物。3. 权利要求1中所述拟茎点霉RPB2基因扩增引物在物种鉴定、地理种群分析以及口岸 检验检疫中的应用。
【专利摘要】本发明公开了拟茎点霉RPB2基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的是针对拟茎点霉属真菌的通用引物。其上游引物PR2-F有44个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。本发明设计的RPB2引物对拟茎点霉属通用性强，扩增测序成功率高，具有合适的片段长度，便于高通量测序与分析，为拟茎点霉分子生态学研究以及检疫鉴定工作提供了重要工具。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105567680
【申请号】CN201510872765
【发明人】胡佳续, 刘鹏, 郭京泽, 王金成, 廖芳, 罗加凤, 张莹, 黄国明
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月2日