CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特异性gRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的 gRNA序列在促进肿瘤细胞凋亡中的应用。
【背景技术】
[0002] CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展 而来，包括三种不同的类型，其中Type II型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个 亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPR RNAs (crRNAs)和trans-acti vating crRNAs (tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可 以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到革El序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif) 附近特异性剪切DNA双链，形成DSB (doub 1 e strand break)。DSB可以通过两种途径被修复， 一种是非同源重组的末端接合(Non-Homologous End Joining NHEJ)DNA修复方式，另一种 是同源重组修复(Homology Directed Repair HDR)方式。NHEJ修复方式可能产生碱基的插 入或缺失，从而产生移码突变，或者也可能突变成终止密码子，这些突变形式都可以改变目 的基因的开放阅读框;HDR方式需要一段与被剪切片段同源的模板片段来修复DSB，这种修 复方式可以将被用来作为模板的同源片段的序列复制到目的基因中，所以可以利用这种修 复方式将特定的基因片段引入到目的基因中。
[0003] 端粒是染色体末端的一段六核苷酸DNA重复序列，被认为是一段沉默基因，它在染 色体末端形成类似保护帽结构，避免染色体从末端双链DNA被核酸酶水解，维持遗传物质的 稳定性和干细胞及肿瘤细胞的无限增值潜能。而端粒DNA由端粒酶催化合成，合成机制涉及 一系列复杂过程，包括酶的生物合成组装、全酶复合物核内的转移定位和活性调控等。端粒 酶是一种具有端粒重复序列的核糖核蛋白复合物，它能够识别端粒特定重复序列，并以自 身RNA序列为模板，以逆转录的形式合成新的端粒序列以补偿有丝分裂过程中丢失的端粒 DNA〇
[0004] 端粒和端粒酶作为维持染色体的稳定的主要结构和细胞寿命的"生物钟"，对于恶 性肿瘤的细胞永生化起到重要作用。当细胞发生癌变时，端粒DNA随分裂活动发生渐进性缩 短的趋势会启动端粒酶，在端粒酶的作用下，正常的人体细胞可转化成具有无限增值能力 的永生化恶性细胞，因此端粒DNA功能的异常是引起细胞衰老和癌变的重要标志之一。
[0005] 端粒酶卡扎尔体蛋白 1 (telomerase Ca jal body proteinl，TCAB1)是2009年新发 现的端粒酶关键核心蛋白组分，它能把端粒酶从卡扎尔体运输到端粒末端的端粒合成目的 地，以确保端粒长度维持机制的正常启动。TCAB1表达的缺失虽然不会影响端粒酶逆转录酶 (TERT)自身的活性剂对端粒酶RNA组分(TERC)的催化，但可在细胞的S期阻止端粒酶复合物 运送至端粒末端合成位点，最终导致端粒的形成和维持受到限制，引起端粒变短，这也意味 着癌细胞会更快地死亡。袁平等人(袁平.RNAi沉默TCAB1表达对肺腺癌A549细胞生物学行 为的影响[D ].浙江大学，2014)利用RNA干扰技术能显著抑制TCAB1 mRNA和蛋白质的表达， 沉默TCAB1的表达能抑制肺腺癌细胞A549细胞中端粒酶与端粒的结合，抑制癌细胞增殖，但 是该研究结果显示RNAi沉默并不能引起癌细胞凋亡。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同 时靶向人TCAB1基因的高效gRNA及其靶位点序列，并用其抑制人TCAB1基因的表达，抑制肿 瘤细胞的增殖，引起癌细胞的凋亡。
[0007] 为实现上述目的，本发明以CRISPR/Cas9系统原理及其gRNA的设计原理为基础，软 件设计预测出六个靶位点，并以px458为表达载体，构建了gRNA/Cas9表达系统，并在肿瘤细 胞模型中加以应用。通过筛选和一系列的分析测试，最终筛选出两条位于第2外显子上的有 效靶点，针对这两个靶点设计的gRNA能使目标靶位点发生移码突变。在人肝癌细胞株 (HepG2)中利用这两个靶点指导的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除人TCAB1基因，这一系 统易于操作，人TCAB1基因敲除效率高。本发明提供的gRNA指导的CRISPR/Cas9系统能高效、 靶向阻断人TCAB1基因，对于CRISPR/Cas9系统充分发挥作用和肿瘤治疗的靶标研究有极其 重要的作用。
[0008] 本发明申请的技术方案如下：
[0009] 1、6条靶向人TCAB1基因的高效gRNA设计合成以及gRNA/cas9表达系统构建。
[0010] 2、在肿瘤细胞模型中分析检测gRNA对于肿瘤细胞增殖的抑制作用以及引起癌细 胞的凋亡作用，筛选到两个有效的靶位点。
[0011] 3、在肿瘤细胞模型中分析检测本发明gRNA指导的CRISPR/Cas9系统对于肿瘤细胞 增殖的抑制作用以及引起肿瘤细胞凋亡的作用。
【附图说明】
[0012]附图 1为T7Endonucl ease I酶切结果(其中1泳道为对照组，2泳道为实验组）；
[0013] 附图2为细胞克隆结果图；
[0014] 附图3为测序结果图；
[0015] 附图4为Western-blot检测TCAB1蛋白表达结果图；
[0016] 附图5为流式检测细胞凋亡图（其中:A为对照组;B为实验组）。
【具体实施方式】
[0017]实施例!靶向人TCAB1基因的gRNA合成及载体构建
[0018] 1、靶向人TCAB 1基因的gRNA的选择和设计
[0019] 在Genebank中找到人TCAB1基因的序列，在人TCAB1基因的外显子区域设计潜在靶 位点。通过在线设计工具(http://crispr .111；[1:.6(111/)及81?嫩的设计原则，评估人11^131基因 序列上得分较高的靶位点设计gRNA，靶位点序列为SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6,并设计对应 的寡核苷酸。
[0020] 2、靶向人TCAB1基因的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表达载体的构建
[0021] 将pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒（Addgene plasmid ID:48138,以下简称 pSpCas9(BB))，用BbS頂每切，37°C水浴1小时后，1 %的琼脂糖电泳，回收酶切产物(TAKARA胶 回收试剂盒）。
[0022] 酶切体系如下：
[0023]
[0024]将靶位点序列为SEQ ID NO. 1的两寡核苷酸退火，形成带有粘性末端的短双链 DNA，反应体系如下：
[0025]
[0026] 将上述反应体系在200ul PCR管中混合均匀，然后将PCR管在37°C水浴锅中处理 30min，再放入500ml沸水中，自然冷却至室温。
[0027]连接体系：
[0028]
[0029]将带有粘性末端的双链短DNA产物连入酶切后的pSpCas9(BB)线性片段，将连接产 物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(Takara Code:D9057A)，并涂布于Ampicillin浓度为100μ g/ml的LB固体平板上培养过夜，挑取生长良好的单克隆，于15ml Ampicillin浓度为100yg/ ml的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，命名为px458-TCABl-l。
[0030] 3、无内毒素质粒DNA的制备
[0031] A、取px458-TCABl-l质粒lyL加入100yL DH5a感受态细胞中吹匀，冰中静置20min， 再放入42°C水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500yL LB液体培养基，放置摇床180rpm37 °Clh，取菌液100yL均匀涂布于Ampicillin浓度为100μg/ml的LB固体培养基37°C培养过夜。 [0032] B、取单菌落于3ml Ampicillin浓度为100μg/ml的LB液体培养基中，250rpm、37°C 振荡培养8小时;从中取300yL菌液接种于300ml Ampici 11 in浓度为100μg/ml的LB液体培养 基中，并于250rpm、37°C振荡培养12~16小时；
[0033] C、收集菌液，然后在4°C、4000rpm条件下离心15min，弃上清，收集菌体，然后按照 QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit试剂盒说明书操作步骤提取质粒，得无内毒素的 px458-TCABl-l 质粒。
[0034]实施例2脂转染HepG2细胞
[0035]转染前3天，复苏人肝癌细胞(HepG2细胞，中科院上海细胞库），将细胞放入加有 10%的FBS+DMEM培养瓶中，于37°(3、5^^02的培养箱中培养，转染前一天，传代培养复苏细 胞。
[0036] 将培养HepG2细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2ml 4°C冰箱取出的0.25 %胰酶，使 其均匀覆盖瓶底，置于37°C培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部 晃下，加入3ml 37°C水浴中预热的10 %DMEM，用10ml移液管进行吹打，吹打6-8次，不留死 角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。 之后，将所有细胞吸出，置于15ml离心管中，取50ul混勾后的细胞于1.5ml eppendorf管中， 加入450ul 10%DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。传代当天记为第 一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75;若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加 10ml 10