一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属植物生物技术领域，具体地，涉及一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物 的方法。
【背景技术】
[0002] 大豆花叶病毒病（soybean mosaic virus, SMV)是由大豆花叶病毒引起的一类世 界性大豆病害，也是我国各大豆主产区最重要的病害之一。SMV-般可造成大豆平均减产 10-30%，严重年份和地区甚至造成大面积绝产。SMV还常常造成籽粒斑驳，严重影响大豆籽 粒的外观品质和商品价值。在分类学上，SMV属马铃薯Y病毒科（Potyviridae)马铃薯Y病 毒属（Potyvirus)，主要通过受侵染的种子，蚜虫和机械接种方式传播。随着全球范围内大 豆种质资源交流，新型病毒株系的出现和致病力强弱的变化，我国大豆抗SMV育种工作面临 的形势也更加严重。由于化学防治困难且易造成环境安全等问题，生产上对大豆花叶病毒 的防治主要依赖于抗SMV大豆品种的培育。研究表明，由于SMV存在复杂的株系分化，大豆 对SMV的抗性又具有株系专化性，因此，寄主的抗性易随着病毒株系的变异而丧失，培育广 谱、抗性持久的抗病品种也成为防治大豆花叶病毒病的根本途径。
[0003] RNA沉默(RNA interference，RNAi)是植物抵抗外来核酸(病毒、转座子等)入侵以 保持自身基因组完整性的一种防御机制。病毒入侵寄主细胞后，其双链RNA(d 〇uble-strand RNA, dsRNA)被植物DCL (Dicer-like)核酸酶加工为vsiRNA (virus short interfering RNA)，随后vsiRNA与AGO蛋白结合，降解与vsiRNAs互补配对的长链病毒RNA，从而阻止病 毒的进一步侵染。许多研究表明，在植物中表达部分病毒基因组序列片段，产生的dsRNA可 以有效抑制病毒的侵染。在大豆抗SMV研究方面，Wang等将携带SMV 3'-UTR的外壳蛋白基因 CP导入大豆，其中2个转基因株系对SMV抗性水平较受体品种显著提高。Furutani等将SMV-CP基因导入大豆，接种鉴定结果表明，转基因大豆植株对SMV侵染具有较高的抗性水平。分 析表明，在转基因大豆的整个发育阶段，SMV-CP序列特异小RNA只出现在真叶阶段，在后续 生长阶段则没有表达。Zhang等和Kim等将SMV-CP基因序列反向重复片段（inverted repeat，IR)导入大豆，接种鉴定结果表明，转基因大豆能够有效抵御SMV的侵染，其抗SMV水 平显著高于受体品种。最近，Gao等将参与转录后基因沉默(post-transcriptional gene Silencing，PTGS)的负调控因子SMV HC-Pro基因 IR片段导入大豆，接种鉴定表明，转基因大 豆对SMV抗性显著提高。可见，利用宿主介导SMV编码基因 RNAi沉默是提高大豆抗SMV的有效 手段，更为重要的是，利用RNAi干扰技术为同时抗多种病毒及病毒不同生理小种提供了一 条更为有效的技术途径。但目前已有的研究主要是通过RNAi介导SMV-CP或SMV-HC-Pro基因 沉默提高大豆抗SMV水平，而对其他参与SMV侵染、复制、运动等过程关键基因 RNAi沉默介导 的SMV抗性研究则尚未见到相关报道。
[0004] 与Potyvirus属其他病毒成员类似，SMV基因组为单链正义RNA，其基因组共编码11 个不同功能的成熟蛋白。P3蛋白是由SMV基因组编码的一个关键蛋白。研究表明，P3蛋白不 仅在病毒复制和运动过程中发挥着重要的作用，同时与感染寄主症状表型密切相关，并在 一定程度上决定了病毒侵染的寄主范围。最近研究表明，P3蛋白是携带Rsvl抗性位点大豆 基因型的无毒决定因子。携带Rsv4抗性位点大豆基因型的无毒决定因子也位于P3蛋白序列 内部，并在SMV致病中发挥着重要的作用。研究表明，Rsvl编码蛋白可以识别P3蛋白，并诱发 大豆产生Rsvl基因介导的超敏感反应(hypersensitive response，HR)。尽管目前尚没有 直接证据表明P3蛋白与植物非宿主抗性机制有关，但也提不P3蛋白在决定大?宿主范围中 发挥着重要的作用，并与SMV致病性有关。因此，抑制SMV-P3基因的转录和翻译可以干扰或 影响SMV的致病性，并在一定程度上影响SMV的宿主范围。基于上述理解，本研究基于宿主 RNAi介导SMV-P3基因沉默干扰SMV的复制和运动，获得了对SMV抗性显著提高的转基因大 豆。在此研究基础上，提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法。
[0006] 本发明提供的RNA片段如SEQ-1所示，可以为双链RNA片段也可以为单 链RNA片段。所述RNA片段可以干扰大豆花叶病毒的复制和运动，从而抑制大豆花叶病 毒症状的发展。
[0007] 本发明提供的双链DNA片段如SEQ-2所示。所述DNA片段可以通过所述RNA片段反转 录获得cDNA片段，或是通过人工合成获得。
[0008] 本发明还提供一种含有特异DNA片段如SEQ-3所示的质粒。所述特异性DNA片段包 括DNA片段1，DNA片段2,以及位于所述DNA片段1和DNA片段2之间的间隔序列。所述DNA片段1 和DNA片段2反向互补。所述DNA1片段1如SEQ-2所示。
[0009] 所述特异性DNA片段从上游至下游可依次包括如下元件：启动子，所述DNA片段1， 所述间隔片段，所述DNA片段2和终止子。所述启动子可为组成型，叶片表达特异型或病毒诱 导型启动子，所述叶片表达特异型启动子优选为菜豆叶片特异启动子RBSC2。
[0010] 含有上述质粒的重组菌或转基因细胞系也属于本发明保护的范围。
[0011]本发明还保护所述RNA片段，所述双链DNA片段，或以上任一所述质粒可用于在培 育抗大豆花叶病毒转基因植物中的应用。
[0012]本发明还提供一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法，包括如下步骤:在目 标植物中表达所述RNA分子，获得对大豆花叶病毒抗性显著提高的转基因植物。所述"在目 标植物中表达所述RNA分子"的实现方式具体如下:将以上所述质粒导入目标植物。所述目 标植物和转基因植物为双子叶植物，所述双子叶植物为大豆，更具体可为栽培大豆。所述质 粒可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管介导法等导入目标植物。
[0013]本发明还保护所述RNA片段，所述双链DNA片段，或以上任一所述质粒在制备大豆 花叶病毒抑制剂中的应用。
[0014] 本发明还保护一种大豆花叶病毒抑制剂，它的活性成分为所述RNA片段，所述双链 DNA片段，或以上任一所述质粒。
[0015] 以上任一所述大豆花叶病毒具体可为大豆花叶病毒SC-3株系。
[0016] 尽管本发明只用SC-3病毒株系进行了抗病接种鉴定，但所述RNA片段是基于多个 大S花叶病毒株系的保守序列，具有广谱性，所以对其它大S花叶病毒株系也具有相同的 抑制效果。
[0017] 本发明对于培育广谱抗大豆花叶病毒转基因植物(特别是大豆)具有重要的应用 价值。
【附图说明】
[0018] 图1为重组质粒PTF101.1-P3的结构示意图 图2为To代PAT试纸条阳性苗PCR鉴定结果.M，DNA标准分子量；Ctl+，质粒 PTF101.1-P3; Wt，非转化植株；1~6为随机选取的PAT试纸条阳性植株. 图3为心~!^代转基因大豆PCR跟踪鉴定结果.M，DNA标准分子量；Ctl+，质粒 PTF101.1-P3; Wt，非转化植株；1~6为转基因大豆B013不同单株；7~12为转基因大豆 B115不同单株. 图4为Τι代转基因大豆Southern杂交鉴定结果.M, DNA标准分子量；Ctl+,质 PTF101.1-P3; Wt,非转化植株；1~6为转Τι代转基因植株B013, B115, B127,B128, B163，B166.植物基因组DNA(50yg)用Hindm酶切后，用DIG标记bar基因探针进行检测. 图5为T3代转基因大豆植株田间接种SMV SC-3叶片症状表现.
【具体实施方式】： 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发 明实质的情况下，对本发明方法所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。实施例中所用的试验材 料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0019] 质粒pHANNIBAL-attB5-RBSC2-attB2:公众可以从吉林省农业科学院农业生物技 术研究所获得。
[0020] 栽培大豆品种W i 11 i a m S 8 2和沈农9号：公众可以从国家作物种质资源数据库 (http: //www · cgris · net/query/cropl ist · php)获得。
[0021] 大豆花叶病毒3号株系（SC-3株系）：为我国大豆产区主要流行SMV株系，公众可以 从吉林省农业科学院植物保护研究所获得。参考文献:郑翠明，常汝镇，邱丽娟，