拟南芥糖基转移酶基因ugt79b2在提高植物抗冷冻性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗冷冻性中的应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常 是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、 在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还 能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles，2004;Bowles et al.，2006;Wang and Hou，2009)。因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育 等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反 应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou，2009)。但是目前为止有关拟 南芥糖基转移酶基因在增强植物抗冷冻性中的应用未见报道。
[0003] 生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同的 家族。其中家族1包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族1中大多数基因 C端具 有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒（plant secondary product glycosyltransferase box)。随着拟南芥（Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成， 通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中 大部分的功能还不清楚。
[0004] 拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2是拟南芥糖基转移酶家族1中的一个成员，目前它 的基因序列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索，有关拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2具有抗冷冻功能及其在增强植物抗冷冻性中的应用未见报道。
【发明内容】
[0005] (1)本发明的目的
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗冻性中的应用。
[0007] (2)本发明的技术方案
[0008] 本发明所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2在提高植物抗冻性中的应用。
[0009] 其中：所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，所 述拟南芥糖基转移酶UGT79B2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述植物优选是十字花科 植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。
[0010] 本发明利用SEQ ID No.3和SEQ ID如.4所示的引物序列，通过1^0?技术从拟南 芥中克隆糖基转移酶基因 UGT79B2，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因 操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的抗冻性得到显著提高。
[0011] (3)本发明实施后可能带来的有益效果
[0012] 本发明第一次证明拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2能够参与植物的抗冷冻胁迫。 实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2进行植物转基因操作，可以显著 提高转基因植物的抗冻性(见附图1、附图2和附图3)。预示本发明实施后将会为创造新型抗 冻植物提供帮助，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
【附图说明】
[0013] 图l.qRT-PCR检测UGT79B2冷冻胁迫诱导实验。取生长状态良好的Col-ο种子，灭菌 后均匀点种子到含MS培养基的培养皿中，4度春化3天后，置于22°C中培养14天。取出lg的 Col-Ο拟南芥，平均置于含有少量水的两个滤纸皿中，一个滤纸皿继续放置在22°C中培养， 一个滤纸皿放置在4°C培养箱中培养，分别隔Oh，3h，6h，12h，24h取材，液氮速冻后，提取 RNA，反转录成cDNA后，用qRT-PCR验证UGT79B2是否受冷冻胁迫诱导。实验结果显示，在冷胁 迫下UGT79B2受到明显上调，并且在6h的时候UGT79B2上调最大。这个结果表明，UGT79B2受 冷胁迫诱导。
[0014] 图2.低温下拟南芥各个株系的萌发率实验。其中以WT (Col-ο)为拟南芥对照植物， 79B20E-7和79B20E-18为两个过表达株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2为两个突变株系。取 生长一致的种子，灭菌后均匀点种子到含MS培养基的培养皿中，每个株系至少点种子150 颗，三次重复。4 °C春化3天后，将对照组培养皿置于22 °C培养，将实验组培养皿置于12 °C培 养，每隔24h统计一次萌发率，连续统计7天。发现对照组中各个株系的萌发率基本一致，没 有差异，实验组中，过表达株系的萌发率总是高于野生型，突变株系的萌发率总是低于野生 型。试验结果表明UGT79B2参与冷胁迫。
[0015]图3.低温下拟南芥各个株系的生长状况实验。其中以WT(Col-O)为拟南芥对照植 物，79B20E-7和79B20E-18为两个过表达株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2为两个突变株 系。取生长一致的种子，灭菌后均匀水平点种子到含MS培养基的方皿中，三个重复。4°C春化 3天后，将方皿垂直置于4°C培养。8周后，观察各个株系表型。发现过表达株系长势要比野生 型好，而突变体的长势要比野生型差。实验结果表明UGT79B2参与冷胁迫。
[0016] 图4.冷冻胁迫下拟南芥各个株系的存活率实验。其中以WT(Col-O)为拟南芥对照 植物，79B20E-7和79B20E-18为两个过表达株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2为两个突变株 系。取生长一致的种子，灭菌后均匀点种子到含MS培养基的培养皿中，每个株系至少点种子 150颗，三次重复。4°C春化3天后，置于22 °C培养12天。然后将培养皿放置在4°C中培养2天， 再将培养皿用碎冰覆盖，一起置于-1°C的冰箱中16h。16h后，拿走碎冰，将培养皿置于-1°C 的冰箱中，并且每隔lh降低1°C，同时取出三个重复含有各个株系的培养皿置于4°C中12h， 再从4 °C中放置到22°C中两天。两天后，观察各个株系的生长情况，拍照并统计其存活率。实 验结果发现过表达株系在各个温度下的冷冻胁迫，存活率总是高于野生型，而突变株系的 存活率总是低于野生型。从图4可以看到，在-6 °C的时候，野生型大部分存活，过表达基本全 部存活，而突变体只有一小半存活。这个结果同样表明UGT79B2参与冷冻胁迫。
[0017] 图5.冷冻胁迫下的电解质渗透率测定实验。对拟南芥各个株系的培养方法同冷冻 胁迫存活率实验中的处理方法。将冷冻胁迫处理之后的拟南芥中的各个株系用清水洗净以 后，用电解质测定仪测定其电解质并计为W1，然后再将测定完电解质的拟南芥在沸水浴中 煮沸lOmin，待其冷却后再将电解质测定仪测其总电解质W2,最后通过电解质渗透率公式来 计算各个株系的电解质渗透率，电解质渗透率的计算公式为W=W1/W2X 100%。实验结果发 现，拟南芥各个株系的电解质渗透率测定中，过表达株系的电解质渗透率总是比野生型高， 而突变株系的电解质渗透率总是比野生型低；其中以WT(Col-O)为拟南芥对照植物， 79B20E-7和79B20E-18为两个过表达株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2为两个突变株系。这 个结果显示UGT79B2参与植物体内的冷冻胁迫，并且还与植物体内电解质渗透相关。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1克隆拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2
[0019] 1.拟南芥糖基转移酶基因 UGT79B2的克隆
[0020] 通过公开网站http: //www · cazy · org获得UGT79B2基因的cDNA序列。根据cDNA序列 设计引物，正向引物为79B2-F: 5 ' -GGATCCCAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC-3 '，反向引物为 79B2-R: 5 ' -GAGCTCTACCAACCTTATTGATCACTCCCT-3 '。利用TRI zol试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UGT79B2基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和SacI酶切， 之后连入相应酶切的pBluescript II SK( + )载体中，构建成测序中间载体，称为pK79B2