一种提高普鲁兰酶活性的方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高普鲁兰酶活性的方法。
【背景技术】
[0002] 普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)不仅能够专一性地水解支链淀粉分支点中的α-l，6糖苷 键，并且能将最小单位的支链分解;在将其与淀粉酶和糖化酶配合使用时，可大幅度提高液 化后淀粉的水解速度和糖化率;在将其与淀粉酶联合作用时，可大大提高麦芽糖得率；由 于这些优良特性，因而普鲁兰酶广泛应用于高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、啤酒及改性淀粉等 的生产中。
[0003] 尽管我国在普鲁兰酶产生菌资源筛选和分子改造及基因工程等方面的研究取得 了一定的进展，但无论是从自然界筛选的菌株还是工程菌株，均存在酶活力低、酶学性质差 等问题，至今尚未实现工业化生产，市场被少数大型跨国公司所垄断，价格昂贵，难以满足 国内食品与发酵等行业的迫切需要。因而提高普鲁兰酶产量或活性是当前急需解决的技术 问题之一。
[0004] 就现有普鲁兰酶生产而言，通过基因工程对普鲁兰酶表达基因进行改造，然后通 过生物发酵工程获得高产普鲁兰酶是较为现实和可行的技术手段。就基因改造设计而言， 现有研究一般认为，几乎所有生物的mRNA的稳定性都影响基因的表达，尤其对原核生物，其 mRNA稳定性通常远远低于真核基因的mRNA，半衰期仅0.5~50 min，因此，提高mRNA的稳定 性，有利于提尚原核生物基因的表达。在对芽抱杆菌基因序列研究的基础上，发明人认为部 分芽孢杆菌基因的5'端和3'端的部分序列对于提高mRNA的稳定性具有较为重要的影响，而 现有技术中，尚未见到将这些序列用于改造普鲁兰酶的报道。
【发明内容】
[0005] 在对芽孢杆菌mRNA序列研究的基础上，本发明认为，通过基因工程操作在普鲁兰 酶基因的5'端和3'端分别附加 SD序列和3t茎环结构序列后，可以较好提高普鲁兰酶表达量 和活性。
[0006] 下面就本发明的技术方案简要介绍如下。
[0007] -种提高普鲁兰酶活性的方法，在利用生物发酵工程制备普鲁兰酶时，通过基因 工程操作手段在普鲁兰酶基因的5 '端增加 SD序列，和/或在普鲁兰酶基因的3 '端增加3t茎 环结构序列，重组构建新的普鲁兰酶基因序列，将该基因序列转化表达后，可以提高普鲁兰 酶活性，并获得较高表达量； 所述SD序列，包括5个碱基，如SEQ ID. 1序列中的第9至13位序列所示，即:GGAGG; 所述3t茎环结构序列，包括479个碱基，如SEQ ID. 1序列中的第3339至3817位序列所 示，即： ATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACCATCTATGATAGTAAGCAAAGGATAAAAAAATGAGTTCATAAAAT GAATAACATAGTGTTCTTCAACTTTCGCTTTTTGAAGGTAGATGAAGAACACTATTTTTATTTTCAAAATGAAGGAA GTTTTAAATATGTAATCATTTAAAGGGAACAATGAAAGTAGGAAATAAGTCATTATCTATAACAAAATAACATTTTT ATATAGCCAGAAATGAATTATAATATTAATCTTTTCTAAATTGACGTTTTTCTAAACGTTCTATAGCTTCAAGACGC TTAGAATCATCAATATTTGTATACAGAGCTGTTGTTTCCATCGAGTTATGTCCCATTTGATTCGCTAATAGAACAAG ATCTTTATTTTCGTTATAATGATTGGTTGCATAAGTATGGCGTAATTTATGAGGGCTTTTCTTTTCATCAAAAGCCC TCGTGTATTTCTCTGTAAGCT。
[0008]所述提高普鲁兰酶活性的方法，操作时具体包括以下步骤： (1) 提取菌株的DNA基因组，设计引物，并以所提取的DNA基因组为模板，进行目的基因 序列的PCR扩增，对扩增产物分别回收备用； 仅在5 '端增加 SD序列时，引物序列可设计如下： SD-pul-F: GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中 5 ' 端TCTAGA表示 Xbal酶切位点） SD-pul-R: GCCGACGTCAATTATTTACTGCTCACCGGCAGG;(其中 5 ' 端GACGTC表示Aat Π 酶切位 点） 仅在3 '端增加3t茎环结构序列时，引物序列可设计如下： pul-3-F: GCTCTAGAGCATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中 5 ' 端TCTAGA 表示 Xbal 酶切位 点） pul-3-R: GCCGACGTCATTATTTACTGCTCACCGGCAGG;(其中 5 ' 端GACGTC表示Aat Π 酶切位 点，其中GGACTAGTCC序列表示Spel酶切位点） 在5'端增加 SD序列的同时在3'端增加3t茎环结构序列时，可设计引物序列如下： SD-pul-3-F: GCTCTAGAGGAGGACAGCTATGCTCAGATATACCTGTCATGCCC，（其中 5 ' 端TCTAGA表 示Xbal酶切位点） SD-pul-3-R: GCCGACGTCAGGACTAGTCCTTATTTACTGCTCACCGGCAGG;(其中 5 ' 端GACGTC表示 Aat Π 酶切位点，其中ACTAGT序列表示Spel酶切位点） 需要注意的是，为在3'端增加3t茎环结构序列，或在5'端和3'端同时增加相应基因序 列时，可以如下引物设计为例，以3t茎环结构序列(可人工合成)为模板，进行PCR扩增， 3T-F: GGACTAGTCCATTAACTAGAAAGTAAAGAAGTAGTGACC，（其中 5 ' 端ACTAGT序列表示SpeI 酶切位点） 3T-R: GCCGACGTCAAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC;(其中 5 ' 端GACGTC表示Aat Π 酶切位 点） (2) 与pMD19-T质粒载体连接， 依据欲在5'端、3'端所增加序列的不同，可分别将将第（1)步中所回收的PCR扩增产物 (即目的基因片段)与PMD19-T质粒载体进行连接； (3) 转化、筛选， 依据欲在5'端、3'端所增加序列的不同，将第(2)步中对应构建的质粒转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，筛选阳性菌株，扩增并提取质粒； (4) 酶切、重连， 仅在5'端增加 SD序列时，将第(3)步骤中所提取的对应质粒与pHT43质粒分别采用Xba I、Aat Π 酶进行双酶切，回收酶切产物，并用DNA连接酶进行连接，然后将连接产物转化至大 肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选、获得重组质粒pHT43-SD-pul; 仅在3'端增加3t茎环结构序列，或在5'端和3'端同时增加基因序列时，将第(3)步骤中 所提取的对应质粒与PHT43质粒分别采用XbaI、Aatn酶进行双酶切，回收酶切产物，并用 DNA连接酶进行连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选、获得重组质 粒 口!^431111-34耵43-5〇1111-3;然后对重组质粒口!^431111-34!^43-5〇1111-3分别采用 Spel和Aat Π 进行双酶切，并回收酶切产物；同时对第（2)步骤中连接有3t茎环结构序列的 PMD19-T质粒载体采用Spel和Aat Π 酶进行双酶切，并回收酶切产物;将采用Spel和Aat Π 酶 进行酶切的双酶切产物采用DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选、 获得重组质粒 pHT43-pul-3t 或 pHT43-SD-pul-3t; (5)转化、诱导表达， 将第(4)步骤中所构建的重组质粒(pHT43-SD-pul、pHT43-pul-3t 或 pHT43-SD-pul-3t) 转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，筛选阳性菌株，并采用液体LB培养基进行培养，在培 养至菌液至0D6Q()=0.6时，加入IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，表达完成后取菌液、裂解菌体、 离心分离取上清，即为含有普鲁兰酶的粗酶液。
[0009] 以中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京)保藏编号为CGMCC N0.10357的克雷 伯氏菌为例，采用上述提高普鲁兰酶活性的方法所重构的普鲁兰酶表达基因 SD-pul-3t，其 碱基序列如SEQ ID.1所示。
[0010] 利用所重构的普鲁兰酶表达基因 SD-pul-3t，所制备的普鲁兰酶。
[0011] 发明人认为，芽孢杆菌的SD(Shine-Dalgarn〇)序列和苏云金芽孢杆菌的3t茎环结 构序列是两个相对保守的序列，对于延长mRNA的半衰期具有较为重要的作用。本发明创新 性的将这两个保守序列单独或共同连接于普鲁兰酶基因时，都能较好地提高普鲁兰酶的活 性，表现出了较好地应用效果。总体而言，本发明不仅对于提高普鲁兰酶产量、改进普鲁兰 酶的应用具有较好地应用前景，同时也为其他基因改造工程提供了较好地借鉴意义。
【附图说明】
[0012] 图1为所提取的克雷伯氏菌基因组DNA电泳图，其中Μ为XHind m DNA marker，l~6 为所提取的克雷伯氏菌基因组DNA; 图2为PCR扩增所获得的Xbal-pul-Aatn片段的电泳检测图，其中Μ为500 bp DNA Marker，l为回收的目的片段Xbal-pul-Aatn ; 图3为PCR扩增所获得的Xbal-SD-pul-Aatn片