枯草芽孢杆菌产绿原酸的发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于发酵菌株高产绿原酸的新发酵方法，具体涉及一种以已经生 长4-5个月的新鲜红薯叶为发酵培养基的基础成分和所用菌株为自身有能力产绿原酸的一 株内生细菌。
【背景技术】
[0002] 绿原酸(CGA)或3-咖啡酰奎尼酸(3-caffeoylquinic acid，3_CQA)是一种缩酸酸， 由咖啡酸与奎尼酸组成，通常通过莽草酸途径产生，在植物如杜仲、金银花、野菊花中存在。 研究表明，绿原酸有各种药效作用包括抗氧化、抗菌、抗过敏、抗癌、降低血糖、抗乙肝B病毒 等作用，以及广泛用于中国传统医药、日用化工和食品等。绿原酸可称作是一种植物黄金， 可从许多药用植物中提取，但其技术复杂且得率并不高，还会对植物本身带来损害。现少有 报道从其中能分离得到产绿原酸的内生真菌，相较而言，产绿原酸的内生细菌鲜有报道。
[0003] 本实验室从金银花叶中分离得到一株自身可以产绿原酸的内生细菌Bacillus subtilis RP5。相比从植物和其内生真菌中提取绿原酸而言，可以节约大量的成本和时间。 虽然找到了一种有效而可替代的微生物来源，但其发酵产量并不高，找到一种新型发酵产 绿原酸的方法尤为重要。
[0004] 红薯叶含有丰富的营养物质，它不仅含有蛋白质、氨基酸、胡萝卜素、维生素和一些 重要的矿物元素，而且富含许多生物活性物质如活性多糖、黄酮类化合物和绿原酸。但是这 种丰富而廉价的资源并未得到大量的利用。红薯叶中含有丰富的绿原酸等酚类物质和大量 的蛋白质、多糖等营养物质。本发明利用其作为发酵RP5的培养基以生产绿原酸是一种非常 可取的选择。
[0005] 由于绿原酸的合成是一种碳素依赖的苯丙烷代谢途径，高浓度的碳源可造成细胞 的高渗透压，在这种胁迫下可产生较高浓度的刺激代谢产物。因此本发明提供了不同浓度 的蔗糖对产绿原酸的影响。与此同时，由于碳源、氮源在产绿原酸的紧密联系，氨态氮的利 用比硝态氮的利用更有利于绿原酸的积累。在植物和内生菌中肯定能含有类似的产绿原酸 的途径，因此培养基的氮源本发明采用铵态氮。
[0006] 本发明利用新鲜红薯叶为发酵培养基基础材料，进行了对培养基的组成成分及 含量的优化探究，以增加 RP5发酵产绿原酸的能力，发现该种发酵方法的确能够大幅度增加 菌株RP5合成绿原酸的产量。进一步的实验确定了该发酵培养基的组成成分的含量及此种 发酵方法下绿原酸的前体和两种异构体的变化。该发明可为绿原酸的大规模生产提供数据 支持和理论依据，也加快了植物内生细菌和红薯叶资源的综合利用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种简单，快速的新发酵方法，大幅度提高原本可以产绿 原酸及其异构体的菌株合成绿原酸的产量。
[0008] 本发明通过如下技术方案实现。
[0009] 本发明通过前期实验分离得到一株内生细菌Bacillus subtilis RP5,该菌株对 人体无害且能产绿原酸，且已于2015年6月14日送交保藏。
[0010] 保藏日期:2015年6月14日，并于2015年6月19日鉴定结果为存活。
[0011] 保藏编号：CCTCC NO: Μ 2015367
[0012] 分类命名：Bacillus subtilis RP5
[0013] 保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
[0014] 保藏单位地址:湖北省武汉市武汉大学
[0015] 本发明为产绿原酸的菌株提供一种新方法的发酵培养基组成及含量，其特征是采 用已经生长4-5个月的新鲜红薯叶为基础材料，结合添加碳、氮源及其它重要离子。然后利 用高效液相色谱法(HPLC)对绿原酸含量进行定量测定，利用液质联用(LC-MS)对培养基和 发酵液中绿原酸前体及异构体进行定性定量检测，确保本发明的可操作性。
[0016] 1植物材料和发酵培养基 新鲜甘薯叶（已经生长4-5月）采摘自成都。取200克新鲜甘薯叶剪碎制成匀浆，煮沸10 分钟，然后单层纱布过滤，添加蒸馏水至1L，得到甘薯叶粗提液。一部分溶液通过微型过滤 器(0.45μπι)过滤除菌备用。但此种方法发酵得到绿原酸的产量比高压蒸汽灭菌得到的产量 要低，因此本发明采取高压蒸汽灭菌115 °C，20min。基础液体培养基0-1)确定为蔗糖(40)， 大豆蛋白胨(10)，氯化铵(5)，硫酸铜(0.04)以及新鲜红薯叶(200)。 _7] 2菌株和培养条件 在我们先前的研究中，Bacillus subtilis RP5分离来源于金银花叶。斜面保存于-4°C 土豆培养基(PDA)以及-40°C，40%甘油管中。液体发酵实验采用250ml三角瓶中加入100ml 液体培养基，接种量2%并在37°C，200rev mirT1的转速下旋转培养28h。
[0018] 3绿原酸提取方法 将菌株RP5活化后接种于100ml红薯叶液体发酵培养基中，摇床培养28h(37°C，200rev mirT1)。离心(5000g，20min)，取上清液，调节发酵液的pH至4，以保持绿原酸的稳定性，加入 等体积70%乙醇超声波处理(40°C，10min)以加快液质转化从而加快提取效率，然后静止过 夜。再用旋转蒸发仪真空浓缩至20ml，浓盐酸调节调节PH至2-3,接着加入等体积乙酸乙酯 萃取三次，每次lh，取乙酸乙酯层真空浓缩至几乎干，加入5ml色谱甲醇完全溶解，用有机滤 膜过滤，除去样品中的不溶物制备成待测样品溶液。
[0019] 4高效液相色谱HPLC分析 HPLC同时测定初始发酵(PDB)和红薯叶作为新的发酵培养基时发酵液中绿原酸含量。 发酵液中绿原酸总产量可达54.60mg Γ1，是RP5初始发酵（1.58mg Γ1)的23.90倍。
[0020] 5液质联用LC-MS分析绿原酸前体和异构体 应用液质联用方法，根据它们的裂解规律和信号强度以及报道的文献为基础，能分离 绿原酸的四种前体标品肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和奎尼酸以及两种异构体新绿原酸-4-咖 啡酰奎尼酸(4-CQA)，隐绿原酸5-咖啡酰奎尼酸(5-CQA)。在四种前体中，肉桂酸酸转化率最 高，可达100 %，对香豆酸酸、咖啡酸、奎尼酸分别为72.4 %，78.4%，33.3 %。两种同分异构 体可达 128.04mg Γ1 是初始发酵（1.74mg
[0021] 本发明与现有技术相比具有以下优点。 1、本发明中新的发酵方法所运用的发酵培养基可以大幅度提高RP5产绿原酸的能力。 其发酵液中绿原酸总产量可达54.60mg Γ1，是RP5初始发酵（1.58mg Γ1)的23.90倍。总绿 原酸的产量包括绿原酸及其两种同分异构体可达128.04mg Γ1是初始发酵（1.74mg Γ1)的 31.74倍。其效果极其显著。 2、 本发明中利用的红薯叶来源广泛，价格非常低廉，容易获取。此外培养基的组成成 分如蔗糖，大豆蛋白胨，氯化铵，硫酸铜也非常低廉易获得。本实验绿原酸的提取方法也相 对简单。 3、 本发明可以应用与其它植物和菌株，把微生物资源和植物资源综合利用起来，真正 做到资源的合理开发。为大规模产绿原酸提供可靠的前景。
【附图说明】
[0022]图1高效液相色谱HPLC分析。图1 HPLC色谱图：绿原酸(杜仲提取)标品