一种核桃低聚肽粉及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种高纯度、低分子量的核桃柏抗氧化肽产品，其多肽含量在80wt % 以上，分子量小于1500Dalton在95%以上。本发明还涉及到核桃蛋白的制备并催化酶解，生 成低聚抗氧化肽粉的制备方法，该肽粉可用作保健食品或者药品。
【背景技术】
[0002] 核桃(Juglans regia L)又名胡桃，属于四大坚果之一，具有很高的营养药用价 值。在我国古医药书籍中，有明确记载，李时珍《本草纲目》记述"补气养血、润燥化痰、益命 门、利三焦，温肺润肠。治肺润肠。治虚寒喘咳，腰脚重疼，心腹疝痛，血痢肠风，散肿毒，"宋 刘翰《开宝本草》载"胡桃（即核桃)味甘、平、无毒。食之令人肥健，润肌黑发，取瓤烧令黑，未 断烟，和松脂，研傅瘰疬疮"。唐化孟诜《食疗本草》中说，核桃仁能"通经脉、黑须发，常服骨 肉细腻光润"。崔禹锡的《食经》说它"多食利小便，去五痔"。《医林纂要》一书的评价是，可以 "补肾，润命门，固精，润大肠，通热秘，止寒泻虚泻。"等等。
[0003] 核桃中含有丰富的蛋白质、脂肪等营养成分，含量比较均衡，属于比较理想的高蛋 白、高脂肪的食物，据报道，核桃仁中含有高达52%_70%的油脂，其中大部分为不饱和脂肪 酸，另外还含有约24%的蛋白质，
[0004] 12 % -16 %的碳水化合物，1.5 % -2 %的纤维素，以及1.7 % -2 %的矿物质。核桃中 富含人体必需的氨基酸，且氨基酸比例比较合理，其中对人体生理作用有着重要功能的谷 氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均较高，其中谷氨酸还是影响人体特别是青少年智力及记忆发 育的重要功能物质。
[0005] 为了获得比核桃原蛋白在营养、功能性及生物活性上更加优良的低聚肽粉，已尝 试了多种制备方法。专利CN 101228918A将核桃柏粉碎，超声波法提取核桃蛋白，将核桃蛋 白真空干燥后，再使用蛋白酶进行酶解，离心，使用透析袋对上清液进行透析，经浓缩透析 液并真空干燥得到含量在60 %~80 %的肽粉。该方法操作复杂，肽含量较低，肽分子量的分 布也不明确，同时使用超声提取蛋白，透析袋进行精致，无法进行大规模制备。专利CN 102406050A使用碱提酸沉方法提取蛋白质，经冷冻干燥得到核桃蛋白粉，蛋白粉经酶解后， 用300Mpa高压处理lOmin，冷冻干燥得核桃肽粉。此制备方法需超高压设备和冷冻干燥机， 成本高，不适宜大规模生产;该发明专利虽然提供了该法制备的核桃肽粉的分子量分布，但 产品中肽含量不明确。专利CN 103103244B使用碱提酸沉的方法提取蛋白质，并用微波结合 超声波处理后，酶解得到多肽粉。该法仍不适用大规模生产，并且没有对酶解产品中肽含量 进行测定。专利CN 104293870A先使用C〇2超临界萃取仪去除油脂后得到的核桃柏，喊提酸 沉后喷雾得到核桃蛋白粉，再将蛋白粉制成悬浊液并煮沸破坏蛋白质的结构，使用碱性蛋 白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶分段四步酶解核桃蛋白液，经5000Dal ton或者 SOOODalton超滤膜精制后使用离子交换树脂脱盐，最后喷雾干燥得到核桃肽粉。此专利涉 及到去除油脂时使用超临界萃取仪，增加成本，不易于大生产;涉及到4种酶分段四步酶解， 步骤繁琐、成本高;涉及到酶解完成后，未经过微滤膜除杂，直接进行超滤膜，造成超滤膜易 阻塞，超滤时间延长，降低多肽收率，同时缩短超滤膜使用寿命;此专利未涉及到多肽产品 中
[0006] 肽的百分含量和肽的分子量分布。
[0007] 可见，以上核桃多肽的制备条件苛刻，工艺步骤繁琐，很难实现大规模生产，因此 寻找一套工艺简单、低成本、高含量、较高活性的核桃多肽的制备方法已经成为寻找大规模 生产的研究热点之一。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供了一种高纯度、低分子量的核桃低聚肽粉。
[0009] 本发明的另一目的是提供了一种高纯度、低分子量的核桃低聚肽粉的制备方法。
[0010] 本发明的另一目的是提供了本发明核桃低聚肽粉用于制备治疗或预防自由基过 多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。
[0011] 本发明的另一目的是提供了含有本发明核桃低聚肽粉的药物和食品组合物。
[0012] 本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
[0013] 一种核桃低聚肽粉，采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量 在80wt%以上，其中95%以上核桃肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
[0014]
[0015] 数均分子量范围：170~3000
[0016] 重均分子量范围：180~4000
[0017] 所述核桃低聚肽粉是通过下述方法制备得到的：
[0018] (1)核桃柏的预处理:将核桃去壳、冷榨脱油，得到脱脂核桃柏。
[0019] (2)逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的核桃柏（记录为A)，与水按重量比 为1:5~1:15混合，调节pH至9~11于室温提取1~2h;提取完成后，过滤，滤渣进行二次提 取，滤液倒入等量的核桃柏(记录为B)，调节pH至9~11于室温提取1~2h;B完成第一次提取 后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取;A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核 桃柏(记录为C)，调节pH至9~11于室温提取1~2h;B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C 完成第一次提取的滤渣中提取1~2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取 后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3~5，静置0.5~2h，弃去上清 液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10~1:20的水，搅拌均匀。
[0020] (3)蛋白酶解:将上述核桃蛋白液加热至40~55°C，将pH值调节至中性，加入核桃 柏重量的0.5~2%中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)或者加入0.5~2%复合酶（中性蛋白酶 与木瓜蛋白酶的质量比为1:1，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g)，搅拌酶解3~6h后，煮沸灭活 30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。
[0021] (4)分离纯化:将蛋白酶解液使用孔径为0.1~0.5μπι的微滤膜进行过滤，透过液再 经2000~20000Dalton超滤膜处理后，截留液在50~80°C下浓缩至固含为3~5wt%时，进行 喷雾干燥，进口温度为140~160°C，出口温度为55~65°C，得到高纯度、低分子量的淡黄色 核桃肽粉，产率可达20~30wt %。
[0022] (5)肽含量与分子量分布测定:采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法， 测得肽含量在80wt%以上，其中95%以上的核桃肽的分子量小于1500Dalton。
[0023] -种组合物，其含有本发明所述的核桃低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
[0024] 根据现有技术，本发明可将所述的组合物制备成任意所述剂型，如，素片、薄膜包 衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
[0025] 本发明所述的核桃低聚肽粉可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药 物、食品或保健品。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0027] (1)本发明将核桃冷榨脱脂制备核桃柏，发明人做了相关实验，与热榨方法相比， 冷榨后蛋白质提取率高出5wt%左右，同时含量高出20wt%左右。
[0028] (2)本发明使用高效逆流法提取核桃蛋白，相比普通的碱提酸沉法，蛋白质的提取 率提高了 10%以上，同时减少了用水量，节约生产成本。
[0029] (3)本发明仅使用蛋白复溶液进行酶解，没有将蛋白进行干燥，这样不仅减少了蛋 白质干燥时的损失，也简化了制备工艺。
[0030] (4)本发明使用中性蛋白酶或者中性木瓜复合酶进行酶解，单酶或者复合酶均能 在含量、分子量、产率、活性上得到保证，酶解工艺稳定，两种酶均为食用酶，来源广泛、成本 低，酶解时，添加量仅为核桃柏质量的1~2 %。
[0031] (5)本发明使用微滤膜进行过滤，初步去除酶解液中的不溶物，再使用2000~ 20000Dalton超滤膜去除大分子量蛋白和肽。
[0032] (6)本发明没有使用冷冻干燥或者真空干燥法制备产品，使用喷雾干燥法不仅节 约了干燥时间，而且产品质粒均匀。
[0033] (7)本发明根据GB/T 22492-2008附录A测定多肽的分子量分布，根据附录B先测定 酸溶性蛋白和游离氨基酸的含量，最后差值即为肽含量。此分子量和肽含量的测定方法认 可度高。
[0034]
[0035]
[0036] 数均分子量范围：170~3000
[0037] 重均分子量范围：180~4000
[0038] (8)本发明测得肽含量在80wt %以上，其其中95 %以上的核桃肽的分子量小于 1500Da 1 ton，是高纯度、低分子量的低聚肽。此外，使用自由基清除法(DPPH、ABTS)和超氧阴 离子自由基清除法(SRSA)三种方法测得此核桃低聚肽均有较好的抗氧化活性。本发明核桃 多肽的制备过程中，经中性蛋白酶或中性木瓜复合酶酶解制得，不同酶酶解得到不同分子 结构的多肽，因此对核桃多肽进行了抗氧化实验从而得到验证。
【附图说明】
[0039] 图1:中性蛋白酶酶解后肽液相色谱图；
[0040] 图2:中性木瓜蛋白复合酶酶解后肽液相色谱图。 实施例
[0041] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法 仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方 法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均购自 Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents 公司。
[0042] 制备实施例1:
[0043] 将100kg冷榨脱脂后的核桃柏（记录为A)，与水按重量比为1:10混合，调节pH至10 于室温提取2h;提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃柏(记录为B)， 调节pH至10于室温提取2h;B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取;A完 成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃柏(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h;B 完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的 滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH 为5,静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10的水，搅拌均匀。将上述核桃 蛋白液加热至45°C，将pH值调节至中性，加入lkg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解 6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为Ο.?μπι的微 滤膜进行过滤，透过液再经50000 &1切11超滤膜处理后，截留液在80°〇下浓缩至固含为3.4% 时，进行喷雾干燥，进口温度为140°C，出口温度为55~65°C，得到高纯度、低分子量的淡黄 色核桃肽粉，产率为21wt%。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量 为81