一种6-氨基青霉烷酸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种6-氨基青霉烷酸的制备方法和青霉素酰 化酶激活剂及其在制备6-氨基青霉烷酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 6-氨基青霉烧酸(6-aminopenicillanic acid，6-APA)为白色片状结晶，是合成各 种半合成青霉素的重要中间体，用途很广。以此为原料进行化学结构修饰，接上不同结构的 侧链，可以制造出对青霉素耐药菌敏感、抗菌谱更广的新的半合成青霉素，如氨苄青霉素、 羟氨苄青霉素、苯氧甲基青霉素，以及其它的具有更宽抗菌谱的各种半合成青霉素。目前国 内6-APA的年产量超过30000吨。
[0003]目前工业上去除青霉素侧链裂解成6-APA，主要有微生物酶催化裂解法和化学裂 解法。随着生物工程技术的迅速发展，采用固定化酶或固定化细胞生产6-APA，不仅工艺大 为简化，经济效益明显，且可得到纯度较高的6-APA。近年来酶法逐渐成为工业上生产6-APA 的主流。
[0004] 化学裂解法。用于工业生产的化学裂解的工艺路线是:在极低的温度下，先将青霉 素的羧基转变成硅酯保护起来，再使侧链上的酰胺活化，通过形成青霉素取代亚胺醚衍生 物，然后在极温和的条件下，选择性地水解断链成6-APA。
[0005] 生物酶催化法。在自然界中细菌、放线菌、酵母和高等真菌都可以产生青霉素酰化 酶。随着现代生物技术的发展，在酶的菌株改良、发酵自动化、酶的大规模化、酶的固定化、 反应器设计、后续工艺等各个领域同时取得进展，青霉素酰化酶用于6-APA的制备已经非常 成熟。固定化酶可以重复使用，容易从反应液中分离，可以有效防止对产物的蛋白污染和微 生物污染等。在反应器内加入一定量的固定化酶，把一定浓度的青霉素溶液与固定化酶在 搅拌的作用下，使酶和青霉素充分接触。在酶的催化下，青霉素不断的裂解成6-APA和苯乙 酸，溶液的pH值下降，补加一定浓度的氨水使pH值维持在8.0，当pH值不在下降并维持10分 钟，到达反应终点。上述的裂解液中加入一定的甲醇，用盐酸调pH值至4.2,使6-APA结晶析 出，然后过滤、干燥得到成品。
[0006] 直通工艺流程。现有的工艺是把青霉素钾盐成品溶解成水溶液，然后裂解。而青霉 素钾盐是从水溶液中提取结晶出来的。为进一步缩短工艺流程，降低成本和能耗，不再使青 霉素结晶出来。在青霉素发酵液的前处理工艺中作适当的工艺改进，得到一定浓度和纯净 度的RB液(青霉素提取过程中的水溶液)进行裂解。并对裂解液萃取，然后结晶得到6-APA。 这样大大简化了工艺流程。
[0007] 以上三种工艺，是随着生物技术的发展和青霉素提取工艺的不断改进等技术进步 的结果。其中，化学法反应条件要求严格，需要使用多种昂贵的化学试剂，并要求在-40°c极 低的温度下反应。另一方面产生环保难处理的高浓度的有机废水。因此化学法基本淘汰。生 物法使用固定酶裂解，固定酶能反复使用上千次，收率也比化学法高3%~5%，因此在很大 程度水提高了生产效率，降低了生产成本，并减轻了环保压力。
[0008] 生物酶催化法中，若能寻找到青霉素酰化酶的激活剂，或许能进一步提高6-APA的 生产效率。目前尚未见相关报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种青霉素酰化酶的激活剂，该激活剂能显著提高青霉素 酰化酶的催化效率，用于制备6-APA时能显著提高6-APA的生产效率。
[0010]上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0011] -种青霉素酰化酶激活剂，化学结构式如下：
[0012]
[0013] 所述的青霉素酰化酶激活剂在制备6-氨基青霉烷酸中的应用。
[0014] 一种6-氨基青霉烷酸的制备方法，包括如下步骤：
[0015] 步骤S1，向青霉素发酵液中加入青霉素酰化酶进行裂解反应，同时加入如上所述 的青霉素酰化酶激活剂，反应结束后得到包含6-氨基青霉烷酸、苯乙酸和青霉素菌丝的混 合液；
[0016] 步骤S2,将混合液依次经过微滤、超滤分离除去青霉素菌丝和大分子物质，将溶液 经过纳滤浓缩得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的浓缩混合溶液;所述微滤、超滤和纳滤中所 使用的过滤膜为有机膜、陶瓷膜或金属膜；
[0017] 步骤S3,将6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的浓缩混合溶液进行脱色处理后，使用树脂 将浓缩混合溶液中的苯乙酸吸附分离，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液；
[0018] 步骤S4,调节6-氨基青霉烷酸的水溶液的pH值至6-氨基青霉烷酸的等电点即可得 到6-氨基青霉烷酸结晶，过滤洗涤干燥后即可得到6-氨基青霉烷酸。
[0019] 进一步地，所述脱色处理中脱色剂为活性炭、三氧化二铝或其组合，所述的树脂为 HPD400和HPD826的混合树脂，体积比为1:1。
[0020]进一步地，所述裂解反应的温度为26~38°C，反应过程中发酵液的pH为7.0~8.5， 裂解反应的反应时间为0.5~2h。
[0021]进一步地，所述超滤中过滤膜的截留分子量为3000~50000道尔顿;所述的纳滤中 过滤膜的截流分子量为100~260道尔顿。
[0022]进一步地，所述步骤S4具体包括:控制6-氨基青霉烷酸水溶液的温度在10~25°C， 使用氨水调节溶液pH值至6-氨基青霉烷酸的等电点，得到6-氨基青霉烷酸的结晶，过滤、洗 涤、干燥;所述6_氨基青霉烷酸的等电点为4.3。
[0023]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制备方法中，所述裂解反应的温度为26~38°C，反 应过程中发酵液的pH为7.0~8.5。裂解反应所需要的青霉素酰化酶用量根据其活性添加， 青霉素酰化酶激活剂的用量根据青霉素酰化酶的用量添加，反应过程中使用氨水调节pH， 当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时，反应结束。反应时间一般在0.5~2h 小时，转化率高达99 %。
[0024]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制备方法中，所述微滤、超滤和纳滤中所使用的过 滤膜为有机膜、陶瓷膜或金属膜，其中超滤膜的精度根据发酵液的质量和膜的通量进行选 择，优选为截留分子量为3000~50000道尔顿的膜组。所述的纳滤膜的截流分子量为100~ 260道尔顿。上述所述的6-氨基青霉烷酸的制备方法中，所述的6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的 浓缩混合溶液中6-氨基青霉烷酸的质量百分浓度为5~15 %。
[0025]上述所述的6-氨基青霉烷酸的制备方法中，还可以包括苯乙酸脱吸附步骤，其中 所述的苯乙酸脱吸附包括如下步骤:使用添加乙醇或丙酮的氢氧化钠溶液洗涤吸附有苯乙 酸的树脂使苯乙酸脱吸附。这样树脂得到再生，同时得到的苯乙酸钠经过进一步精制可以 作为原料应用于青霉素发酵生产中。
[0026] 本发明的优点：
[0027] 本发明提供的青霉素酰化酶激活剂能显著提高青霉素酰化酶的催化效率，用于制 备6-APA时能显著提高6-APA的生产效率，是不添加激活剂时生产效率的3倍多。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0029] 实施例1:6-APA的制备
[0030]将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在30~34°C的搅拌 反应器中，搅拌。待发酵液的温度达到30~34°C时，加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和 如下结构所示的青霉素酰化酶激活剂5mg，进行裂解，并在裂解过程中不断滴加浓度为10% 的氨水，将反应器中pH值维持在7.6左右，当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不 变时，反应结束。
[0031]将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青 霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留 分子量为3000~5000道尔顿的超滤器，除去大分子蛋白质等杂质。
[0032]将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器，使混合溶液得 到浓缩，浓缩至6-APA的质量浓度为10%。
[0033]利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色，得到脱色后的混合液。
[0034]利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附，经固液分离，分 别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为HPD400和HPD826的混合树脂， 体积比为1:1。
[0035] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中，结晶器内温度控制在15~20°C，向结晶器内加 氨水，逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI = 4.3)，得到6-APA的结晶，过滤、洗 涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0036]青霉素酰化酶激活剂结构式如下：
[0037]
[0038] 实施例2:6-APA的制备
[0039] 将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在26~30°C的搅拌 反应器中，搅拌。待发酵液的温度达到26~30°C时，加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和 青霉素酰化酶激活剂5mg，进行裂解，并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水，将反应 器中pH值维持在7.0~7.6,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时，反应结 束。
[0040] 将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青 霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留 分子量为3000~5000道尔顿的超滤器，除去大分子蛋白质等杂质。
[0041] 将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器，使混合溶液得 到浓缩，浓缩至6-APA的质量浓度为5%。
[0042]利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色，得到脱色后的混合液。
[0043]利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附，经固液分离，分 别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为HPD400和HPD826的混合树脂， 体积比为1:1。
[0044] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中，结晶器内温度控制在10~15°C，向结晶器内加 氨水，逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI = 4.3)，得到6-APA的结晶，过滤、洗 涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0045] 实施例3:6-APA的制备
[0046]将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在34~38°C的搅拌 反应器中，搅拌。待发酵液的温度达到34~38°C时，加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和 青霉素酰化酶激活剂5mg，进行裂解，并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水，将反应 器中pH值维持在7.6~8.5,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时，反应结 束。
[0047]将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤