具有不同表达量的基因的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性检索方法 以及与表型相关的遗传多态性的检索方法。
【背景技术】
[0002] 即便是处于基因组相同位点的相同基因，当位于不同等位基因上时其基因表达量 不同的现象是近年来报告的比较新的概念(非专利文献1:Knight JC. Allele-specific gene expression uncovered (等位基因-特异性基因表达无遮盖）· Trends Genet. Mar; 20(3): 113-6. PMID: 15049300、2004年）。
[0003] 在等位基因之间显示不同表达量的基因大致分为印迹基因和非印迹基因两种。前 者所谓的印迹是指在某种细胞或组织中，当从双亲各遗传一半等位基因时，任意一方受到 生理性纯化(例如甲基化等），基因的表达被抑制的现象。后者，即非印迹基因中，有时也会 在等位基因之间可见不同表达量的情况。这是由于，基因内或与其邻近的等位基因之间的 基因组的多态性作为调节附近基因的表达的顺式作用区域起作用，产生等位基因之间的基 因表达量的差别。在后者中可见的、由于基因组DNA序列的不同所引起的每个等位基因的表 达变化认为是超过世代遗传而来的性质，会影响个体间的基因表达量的差别、甚至个体的 体质差别、病态及其危险率、或者对药物应答性的不同。
[0004] 为了测定等位基因之间基因表达量的差别，在同一细胞内、即在相同环境条件下 进行测定是最为精确的。而且在测定等位基因之间的基因表达量的差别时，重要的是能够 鉴定某个RNA是来自于哪个等位基因。因此，能够区别等位基因的多态性(SNP等）必须也存 在于作为基因转录产物的RNA序列上，通过对其进行测定从而能够鉴定。目前已经有数个使 用该RNA上的多态性(SNP)测定等位基因之间的表达量差别的报告(非专利文献2~4:C 〇wles CR， Hirschhorn JN， Altshuler D， Lander ES. Detection of regulatory variation in mouse genes (在小鼠基因中调节变异的检测）· Nat Genet. Nov; 32(3): 432-7. PMID: 12410233、2002年；Yan H， Yuan W， Velculescu VE， Vogelstein B， Kinzler KW. Related Allelic variation in human gene expression (在人类基因表达中相关的等 位基因变异）· Science. Aug 16; 297(5584): 1143. PMID: 12183620、2002年；Bray NJ，Buckland PR, Owen MJ, O'Donovan MC. Ci s-acting variation in the expression of a high proportion of genes in human brain (顺式作用变异在人脑基 因的高比率表达）· Hum Genet. 2003 Jul; 113(2): 149-53. Epub May 01. PMID: 12728311、2003年）。
[0005] 这些报告均是组合了 RT-PCR法和直接测序反应或单核苷酸延伸反应的技术，即由 mRNA合成cDNA，扩增后，将任意选择的多态性分别地分型，并非是能够同时测定多个基因的 技术。
[0006] 到目前为止，有一个使用SNP分型用微阵列广泛分析多个基因的报告（Lo HS， Wang Z, Hu Y, Yang HH, Gere S, Buetow KH, Lee MP. Allelic variation in gene expression is common in the human genome (在人类基因组中等位基因变异在基因表 达中是常见的）· Genome Res. Aug; 13(8): 1855-62. PMID: 12902379、2003年）。这里， 通过使用了 polyT引物的普通RT法将带有PolyA的mRNA转变为cDNA，根据与通常的基因组 DNA分型技术同样的实验规程，利用使用了多个特异引物的多重PCR法调制样品，使样品杂 交于阵列，根据其信号比测定每个等位基因不同的cDNA (mRNA)的表达量比。但是，在带有 polyA的成熟型mRNA中，仅为剪接后的外显子的序列，其长度很短、能够评价的多态性(SNP) 也很少。因此，能够利用的多态性(SNP)有所局限，难以发现在每个等位基因上表达量均有 差别的基因。
[0007] 另一方面，遗传多态性与特定表型及基因表达(例如疾病、药物有效性的不同）的 关联性也备受关注。但是，在研究特定遗传多态性与表型及基因表达的关联性时，例如在基 因组上为SNP时，对于每个性状必须对多个SNP (2004年10月报告的NCBI dbSNP build 123 中约1000万)进行研究，对所有SNP进行研究是很困难的。
[0008] 因此，如果能够迅速且高效地选择在等位基因之间表型及基因表达不同的基因、 研究如此选择的遗传多态性与表型及基因表达的关联性，则可以探讨疾病的原因或有效的 治疗方法等。
【发明内容】
[0009] 因此，本发明鉴于上述事实，其目的在于提供迅速且高效地检索能够判定在等位 基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的方法。本发明的目的还在于，利用通过该方法 检索的遗传多态性，检索与表型相关的遗传多态性的方法。
[0010] 本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过利用存在于核内RNA 上的遗传多态性，可以高效地发现在等位基因之间表达量不同的基因，在该方法中，当选择 能够选择性地扩增核内RNA的DNA聚合酶时，成功地鉴定了实际上能够判定在等位基因之间 表达量不同的基因的遗传多态性(SNP)，进而完成了本发明。
[0011]即，本发明包括以下内容。
[0012] (1)用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性的检索方法，包括 以下步骤： (a) 通过使用了随机引物的逆转录反应，由总RNA或核内RNA合成cDNA的步骤； (b) 使用随机引物和在等温下反应的链置换DNA聚合酶，选择性地扩增来自于较长核 内RNA (-次转录产物）的cDNA的步骤； (c) 检测扩增的cDNA中存在的遗传多态性的步骤； (d) 根据该遗传多态性，比较来自于位于基因组DNA的遗传多态性为杂合型的基因组 上各等位基因的cDNA表达量的步骤； (e) 当来自于各等位基因的cDNA表达量显著不同时，选择比较所使用的遗传多态性的 步骤。
[0013] 在上述检索方法中，作为DNA聚合酶例如可以使用Φ 29 DNA聚合酶。
[0014] 在步骤(c)和(d)中优选包括以下步骤:标记扩增的cDNA，进行使用了遗传多态性 特异性探针的杂交，根据该反应比较来自于各等位基因的表达量。
[0015] 在上述检索方法中，可以使用单核苷酸多态性(SNP)作为遗传多态性。
[0016] (2)与表型相关的遗传多态性的检索方法，其包括使用通过上述检索方法检索的 遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系。
[0017] 在上述检索方法中，作为表型，可以举出疾病的病态和严重程度、疾病的发病危 险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性以及对环境因子的应答性等。
[0018] (3)与遗传多态性相关的表型的检索方法，其包括使用通过上述检索方法检索的 遗传多态性，研究遗传多态性或基因表达量与表型的关系。
[0019] 在上述检索方法中，作为表型，可以举出疾病的病态和严重程度、疾病的发病危 险、对药物的应答性、对食品的应答性、对化学物质的应答性以及对环境因子的应答性等。
[0020] 通过本发明提供了用于检索能够判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传 多态性的迅速且高效的方法。由于如此检索的遗传多态性能够识别等位基因之间的表达 量，因此是用于分析该基因相关表型的有效方法。而且，认为如果能够发现如此检索的遗传 多态性和表型(疾病危险率或药物应答性)的关系，则可以探讨疾病的原因或有效的治疗方 法等。
[0021 ] 附图简述 图1为通过使用了 Φ29 DNA聚合酶的扩增获得的CDNA的电泳照片； 图2为表示淋巴细胞BL1395的cDNA和基因组的信号比的频率分布与该遗传多态性(探 针组合)存在的基因组上的基因的位置关系的图； 图3为表示淋巴细胞BL2122的cDNA和基因组的信号比的频率分布与该遗传多态性(探 针组合)存在的基因组上的基因的位置关系的图； 图4为在表达分析用阵列U133plus2和100K阵列(Xbal 50K)中的cDNA/基因组的信号比 的比较图； 图5为显示PPAR γ基因上的SNP位点的图； 图6为显不使用直接测序法确认SNP的不意图； 图7为显示30名日本人的外周血淋巴细胞的PPARG基因表达量与遗传多态性分型的关 联性的图； 图8Α和Β为显示30名日本人的外周血淋巴细胞的PPARG基因表达量与遗传多态性分型 的频率分布(Α)以及单倍型Μ和m的等位基因的图。
[0022]实施发明的最佳方式 以下，详细地说明本发明。本申请主张了2004年12月17日申请的日本国专利申请第 2004-366671号的优先权，包括上述专利申请的说明书和/或附图所