一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及癌症风险预测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌风险预测的基因检测 引物组和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 根据中国肿瘤防治研究办公室和全国肿瘤登记中心发布的2013年肿瘤登记工作 总结，2010年我国登记地区恶性肿瘤病例高达315.7万，累积发病率为21.51 %，累积死亡率 为13.49%，成为我国居民的第二大死因。其中肺癌的累积发病率在所有癌症中排第一位， 尚达3.7%，死亡率更是远尚于其它癌症，是我国癌症第一杀手。
[0003] 吸烟与肺癌的发生有显著相关性，12.56%的死亡因素可归结于吸烟。肺癌的发生 通常是一个缓慢的过程，除了吸烟等环境因素外还有癌症基因变异、携带肿瘤风险基因等 遗传因素，是基因与环境共同作用的结果。
[0004] 通过基因检测和遗传咨询，可以预测一些肿瘤的发病风险，了解到风险基因是否 会遗传给下一代，还可以结合肿瘤预防手段管理个体健康。当前，我国的基因检测和遗传咨 询还处于发展初期，早期的疾病预防往往被忽视，更多的人是在发病中期甚至是晚期才觉 察到。肺癌作为"难治"的肿瘤，更应该注重预防和早期筛查。通过基因检测，预测肺癌发病 风险，从而实现早知道、早预防。
[0005] 当前的肺癌风险预测基因检测，大多基于高加索人的遗传特征。由于遗传的异质 性、基因多效性等，例如肿瘤易感位点、易感位点突变频率、肿瘤发病率在不同的种群中会 有不同程度的差异，特别的，来源于全基因组关联分析研究(GWAS)的肿瘤易感位点对种群 的要求更是严格，这些因素促使肿瘤风险预测基因检测需要根据中国人群的遗传特征进行 优化。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒，针对中国人群肺 癌的易感位点，结合可乘性风险评估模型，可以有效预测肺癌发病风险。
[0007] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组， 包括用于进行肺癌易感SNP的PCR扩增反应的正向引物序列SEQ ID N0:1-22、反向引物序列 SEQ ID N0:23-44,以及用于进行单碱基延伸反应的特异性延伸引物序列SEQ ID N0:45-66〇
[0008] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于肺癌风险预测的基因检测试剂盒， 包括第一方面的引物组，即包括用于进行肺癌易感SNP的PCR扩增反应的正向引物序列SEQ ID Ν0:1-22、反向引物序列SEQ ID Ν0:23-44,以及用于进行单碱基延伸反应的特异性延伸 引物序列SEQ ID Ν0:45-66。
[0009] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于进行PCR扩增反应的其 它组分。
[0010] 作为本发明的优选方案，上述用于进行PCR扩增反应的其它组分包括PCR缓冲液、 镁离子、dNTP混合物、DNA聚合酶和水中的一种或多种。
[0011] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于对PCR产物进行处理的 碱性磷酸酶。
[0012] 作为本发明的优选方案，上述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。
[0013] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于进行单碱基延伸反应的 其它组分。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述用于进行单碱基延伸反应的其它组分包括延伸反应 缓冲液（iPLEX缓冲液，iPLEX Buffer plus)、反应终止子（iPLEX终止子，iPLEX terminator)和反应用酶（iPLEX酶，iPLEX enzyme)中的一种或多种。
[0015] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于对上述单碱基延伸反应 的产物进行纯化的树脂。
[0016] 作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于接受上述纯化后的产物 点样的芯片。
[0017] 现有的肿瘤风险预测通常使用高加索人群数据，不同群体的遗传差异会导致预测 效果大打折扣。本发明针对中国人群肺癌的易感位点，结合可乘性风险评估模型，可以有效 预测肺癌发病风险。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明一个实施例的肺癌风险预测模型AUC曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0020] 本发明使用全基因组关联分析研究(GWAS)中针对中国人群的肿瘤易感位点，筛选 出可以有效预测肺癌发病风险的22个单核苷酸多态性位点（SNP);根据这些SNP，设计相应 的用于PCR扩增反应和单碱基延伸反应的引物组;采集受检者的唾液或者血液样本提取出 DNA;通过飞行时间质谱(T0F-MS)技术，准确检测出肺癌易感SNP的基因型。最终通过基因分 型结果，使用可乘性风险模型(multiplicative risk model)，分析受检者肺癌发病风险， 进而可以根据预测结果，制定科学有效的个体健康管理计划，降低高风险因素带来的影响。
[0021] 发明人已经证明，采用本发明的引物组进行中国人的肺癌风险预测效果优异，表 现在其模型AUC结果良好，目前还没有能够实现这么优异的效果的肺癌风险预测技术。
[0022] 在本发明的一个实施例中，通过筛选全基因组关联分析研究(GWAS)中的肺癌易感 位点，检测这些单核苷酸多态性(SNP)的基因型，结合数学分析模型，预测肺癌的发病风险。 步骤概括如下：
[0023] 1.筛选GWAS研究中的肿瘤易感位点
[0024]在美国国家生物信息中心(NCBI)的文献检测系统(pubMed)上搜索基于中国人群 的GWAS研究中的肺癌易感位点，同时检索GWAS Catalog提供的数据库，筛选出GWAS研究中 阳性样本量超过750例、校正后的P值〈0.01、在大规模病例对照组研究中得到验证的易感位 点，并要求这些位点在中国人群中频率不低于〇 . 05，如果SNPs之间的连锁不平衡系数r2> 0.8，则选取比值比(OR)最大的SNP。
[0025] 筛选后得到的肺癌易感位点，如表1所示。
[0026] 表 1
[0027]
[0028] 2.使用商业试剂盒提取人唾液中基因组DNA
[0029] 使用Hipure Blood DNA Mini Kits(Magen，D3111)或类似产品，提取唾液或血液 中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。 将质检合格的DNA浓度调整到30-50ngAiL，转移至384孔板，-20 °C储存备用。
[0030] 3.使用飞行时间质谱(T0F-MS)技术基因分型
[0031] 检测过程结合多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解 吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)进行分型检测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩 增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延 伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基 差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技 术，检测延伸产物分子量的大小，应用专用的分析软件，通过判断分子量的差异而进行SNP 分型检测。详细过程包括步骤4~10。
[0032] 4.引物设计及合成
[0033]设计并合成待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。SNP位点及对应的PCR 扩增引物和延伸引物序列见表2。
[0034] 表 2
[0035]
[0038]
[0039] 5.PCR 扩增
[0040] 采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5yL。
[0041 ] (1)在一个新的1.5ml EP管中配制PCR预混合液(PCR master mix)溶液，如表3所 不。
[0042] 表 3
[0043]
[0044] (2)使用24通道加样器，调节加样体积为4yL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR 预混合液。该384孔板即为PCR反应板。
[0045] (3)取出已经制备好的DNA样品384孔板，使用24通道加样器，调节模板加样体积为 lyL，每个5yL PCR反应体系中包含模板DNA 20-50ng，Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物 0.5pmol，0.1yL的25mM dNTPs。
[0046] (4)在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为:94°C4分钟；94°C20秒，56°C30 秒，72 °C 1分钟，45个循环;72 °C 3分钟;4 °C保持。将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR 反应。
[0047] 6. PCR产物碱性磷酸酶处理
[0048] 在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP (shrimp alkaline phosphatase，4下喊