用人骨髓间充质干细胞预测遗传毒性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种评价化学品或环境样品早期遗传毒性的方法，可用于新药研发、 农药开发、新型材料研制、化学物质与食品安全性评价、环境监测等涉及人体健康或环境风 险评价的领域。
【背景技术】
[0002] 在我国新药、农药、化学品、食品、化妆品及消毒剂等产品的开发研制过程中，遗传 毒性试验被正式列入安全性评价的准则或测试规范。遗传毒性与致癌性密切相关，在致癌 性测试筛选中起到重要作用。此外，监测水源、空气及职业环境中遗传毒性物质的存在，也 需要灵敏、快速、准确的方法。
[0003] 现阶段遗传毒性检测的常用体外试验主要包括细菌回复突变试验(Ames试验）、哺 乳动物细胞染色体畸变试验和小鼠淋巴瘤细胞试验。这些体外检测方法在遗传毒性评估方 面发挥着重要作用，也是世界各国现阶段普遍推荐和接受的检测方法。但是，这些体外方法 有很多局限性：（1)假阳性结果比例较高；（2)细胞都是生长在体外环境的二维空间中并且 处于对数生长期，这与复杂的体内三维环境相似度较低；（3)这些方法所采用的检测体系均 为微生物或动物细胞株系，因此所得数据与人体系统相关性较低，使得试验数据不能进行 有效的外推。现有化学品安全性评价常用遗传毒性体外实验和动物模型对评价结果尤其是 在将结果外推于人类时造成较大的不确定性，可能造成化学品由于假阳性结果而终止继续 研发，或者经大量应用后才暴露其毒性效应，对环境和人类健康造成潜在危害。
[0004] 针对现有遗传毒性检测方法的局限性，将人类干细胞应用于遗传毒性检测有望建 立一种良好的动物试验替代方法。人骨髓间充质干细胞作为遗传毒性检测平台，可以避免 物种差异导致的体外哺乳动物细胞试验系统假阳性过高的问题。欧洲替代试验方法验证中 心(ECVAM)已经验证了若干种基于鼠胚胎干细胞的发育毒性检测方法，利用干细胞进行毒 性测试是化学品安全性评价的重要发展趋势。人骨髓间充质干细胞用于遗传毒性研究与动 物实验、癌细胞系和成体细胞相比具有显著优势。人骨髓间充质干细胞是正常的人细胞系， 不但可以在体外多代长期培养和大规模扩增，还具有完整的P53基因调控通路，能准确地反 应出受到遗传损伤后细胞的应激效应。通过检测化学品对DNA损伤通路上关键基因的表达 变化的影响，对化学品的潜在遗传毒性安全性评价具有预测性。
[0005] DNA损伤反应通路是与遗传毒性密切相关的通路，DNA损伤应激通过蛋白激酶被激 活，导致细胞周期阻滞、DNA损伤修复和细胞凋亡等关键事件的发生，DNA损伤导致ATM和ATR 基因表达上调，激活DNA损伤蛋白激酶，p53基因被蛋白激酶憐酸化后，p53基因表达上调， 激活下游基因 P21导致细胞周期阻滞，激活下游基因 Gadd45a促进DNA损伤修复，还会调控促 凋亡基因 Bax表达上调促进细胞凋亡。ATM、ATR基因对DNA损伤应答通路具有激活作用，DNA 损伤也会刺激ATM、ATR基因的表达。p53基因不仅是重要的抑癌因子，也对DNA损伤修复、细 胞周期调控以及细胞凋亡发挥着关键作用。P21基因是p53的下游激活产物，p53和p21的相 互调节对于使损伤的细胞发生细胞周期阻滞是必须的。Gadd45a基因也是p53基因下游基 因，导致细胞周期G2期阻滞以及DNA损伤修复。γ -H2AX蛋白是DNA双链断裂的重要标志物， H2AX基因表达变化也与DNA双链断裂以及相关的DNA修复信号密切相关，H2AX基因受到DNA 损伤通路上的蛋白激酶的调控对DNA损伤修复进行应答。因此，人骨髓间充质干细胞DNA损 伤反应通路上的所述关键基因，作为基因标志物用于早期遗传毒性检测，具有灵敏、快速、 准确的优势。
【发明内容】
[0006] 本发明根据遗传毒性测试动物试验和体外测试方法的不足，提出了一种利用人骨 髓间充质干细胞标志基因预测化学品早期遗传毒性的体外评价方法。
[0007] 本发明技术方案：
[0008] 用人骨髓间充质干细胞预测遗传毒性的方法，步骤如下：
[0009] (1)人骨髓间充质干细胞体外培养与增殖，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养 瓶底部50 %以上，冲洗掉培养基，加入胰蛋白酶进行消化，收获人骨髓间充质干细胞；
[0010] (2)人骨髓间充质干细胞接种与体外暴露：调节步骤(1)获得人骨髓间充质干细胞 密度至0.1 X 1〇6-1 X 1〇6个/mL，接种于孔板中，培养24h，待人骨髓间充质干细胞适应培养环 境，对其进行体外化学品暴露处理；
[0011] (3)人骨髓间充质干细胞RNA提取，收获经步骤⑵处理的细胞，提取总RNA;
[0012] (4)采用实时定量PCR进行所述生物标志基因的mRNA表达的检测。
[0013] 本发明的有益效果：本发明提供了一种灵敏、快速、准确的体外遗传毒性检测方 法。本方法使用人骨髓间充质干细胞作为遗传毒性检测平台，避免了使用微生物或动物细 胞株进行遗传毒性检测由于种属差异使得试验数据不能进行有效的外推。以一个或几个基 因作为标志物预测化学品潜在遗传毒性更加灵敏，在造成DNA损伤的初期(低剂量暴露时） 可以发现标志基因的异常表达，从而预测化学品潜在遗传毒性。
【附图说明】
[0014] 图la为内参基因(GAPDH)熔解曲线图。
[0015] 图lb为ATM基因熔解曲线图。
[0016]图lc为ATR基因熔解曲线图。
[0017]图Id为p53基因熔解曲线图。
[0018] 图le为Gadd45a基因熔解曲线图。
[0019]图If为p21基因熔解曲线图。
[0020]图lg为H2AX基因熔解曲线图。
[0021]图lh为Bax基因熔解曲线图。
[0022] 图2为不同浓度遗传毒性模式化学物-甲磺酸甲酯（MMS)对ATM、ATR、p53、p21、 Gadd45a、H2AX和Bax基因表达影响图。
[0023] 图3为不同浓度烯啶虫胺(nitenpyram)对六了]\^了1?、？53、!124乂和831基因表达影响 图。