用于稻田广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种用于稻田生态系统广食性捕食天敌 猎物多样性高通量测序的复合标签及其应用。
【背景技术】
[0002] 稻田广食性捕食天敌与稻田有害生物防治技术研发密切相关，由于节肢动物形态 分类的困难和捕食性天敌猎物检测识别技术的限制，阻碍了稻田生态系统捕食性天敌猎物 谱及猎物转换机制和生防技术的深入研究，宏条形码技术的出现使此问题的解决变为可 能。因此，利用节肢动物独特的线粒体基因组细胞色素 C氧化酶I基因（C0I)为靶标序列 (Hebert等，2003.Hebert P，et al.，2003.Biological identifications through DNA barcodes .Proceedings of the Royal Society ,270( 1512) :313-321 )，用PCR扩增的方法 从复杂样本中富集节肢动物或捕食性天敌体内残留的猎物DNA，利用所扩增序列代表种的 特异性来检测捕食性天敌的猎物谱，是一种非常有效的方法。
[0003] 本发明所指的节肢动物线粒体基因组细胞色素 C氧化酶I基因（C0I)微型条形码区 域是指稻田生境中全部节肢动物C0I微条形码序列的总和，为研究节肢动物多样性、种群结 构、进化关系、相互协作关系及与环境之间的关系提供了一条新的思路。
[0004] 在动物分类领域，DNA barcoding采用的标记基因主要是线粒体⑶I基因；该基因 在引物对应部分比较保守，其它序列部分变异相当大，并且容易利用通用引物进行PCR扩 增；同时在近缘种间，这段基因的差异也足够大，因此适合作为动物分子鉴定的标记，也是 目前在动物分子生态学上应用最广泛的分子标记。线粒体DNA(mtDNA)结构简单、几乎不发 生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点，被公认为是研究动物系统发育 的重要标记。线粒体基因组包括13个蛋白质编码基因，2个rDNA基因，22个tRNA编码基因和 一个非编码区。最常见于物种鉴定研究的mtDNA基因是细胞色素 C氧化酶I基因（C0I)和16S rRNA基因。由于C0I基因具有相对高的种间变异和低度的种内变化，以及相当长的变化序 列，又容易扩增，使得C0I成为能够鉴别密切相关的物种的重要DNA条形码之一。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种用于广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其应 用，提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中所含稻田 节肢动物种群，为探明稻田捕食性天敌猎物谱及其猎物转换机制研究提供高通量分析途 径。
[0006] 该种用于稻田生态系统广食性捕食天敌猎物多样性高通量测序的复合标签及其 喊基序列如下序列编号NO. 1~N0.48所不。
[0007] 本发明复合标签的每一条序列均由左侧8~12个碱基组成具唯一性序列和右侧23 ~27个源于细胞色素 C氧化酶I基因（C0I)的序列所组成。其中，右侧23~27个源于C0I的序 列具有一定的简并性，序列中的R为A或G; S为C或G; W为A或T; Y为C或T。
[0008] 表1复合标签序列。
[0009]
[0010]
[0011] 本发明还提供一种利用所述复合标签进行超高通量基因测序的方法，包括如下步 骤：
[0012] ⑴提取每一个样本的总DNA;
[0013] (2)对每一个样本，从所不48对且未被选择过的复合标签序列中选择任意一对序 列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；
[0014] (3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；
[0015] (4)对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量；
[0016] (5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；
[0017] (6)对所建测序文库进行高通量测序。
[0018] 本发明所述稻田节肢动物细胞色素 C氧化酶I基因序列是指所有落在动物线粒体 基因组C0I基因之间的区域的总和，复合标签如表1所示;利用表1的稻田节肢动物细胞色素 C氧化酶I基因序列复合标签可达到在一次超高通量测序中同时对1~48个样本中的稻田节 肢动物C0I基因序列进彳丁检测。
[0019] 利用目前超高通量测序自身提供96种测序标签(8~12个碱基），可做96个样本，但 需在超高通量测序前先对96个样本分别建96个测序库，然后等量混合成1个再同时测序，而 本发明只需建1个库就能对48个样本同时测序。如果将测序自带的96个标签和本发明的48 个复合标签结合使用，则同时可对96X48个样本的稻田节肢动物细胞色素 C氧化酶序列进 行超高通量测序。
[0020] 步骤(1)中对每个样本总DNA提取采用通用提取方法。
[0021] 步骤(2)中对每一个样本从表1所示48对且未被选择过的序列中选择任意一对序 列作为引物，其选择原则具体为:确定每一样本的编号，对每一个编号样本，从表1中选择一 序列编号所对应的序列1和序列2(N0.1的序列1和序列2为一对，N0.2的序列1和序列2为一 对，N0.3的序列1和序列2为一对，以此类推），确定每一个样本的一对序列;每个编号的样本 可选表1中48对中的任何一对，但要求不同编号的样本之间从表1选择时不要重合，即不同 编号样本不选择同一个复合标签。
[0022] 步骤(2)中对对应样本的总DNA进行扩增的扩增体系为：
[0023] PCR扩增的50yL体系中含：lyL样本总DNA，25yL 2XBuffer，10yL dNTP，lyL K0D FX酶，浓度为ΙΟμΜ引物各5yL，补水至50yL。
[0024] ?0財广增程序:94°(：预变性21^11;98°(：变性1〇8,45°(：退火3〇8,68°(：延伸3〇8,31个循 环;68°C延伸lOmin;产物4°C保存。
[0025] 步骤(3)中对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。
[0026] 步骤(4)中DNA精确定量使用Life technologies invitrogen的QilMfdsDNA HS Assay试剂盒或者分光光度计。
[0027]本发明所述高通量测序采用基于Ion Proton第二代超高通测序仪的测序平台进 行。
[0028]优选地，步骤(5)中建库所用建库试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应 的Ion Xpress? Plus gDNA Fragment Library Preparation试剂盒。
[0029] 步骤(6)中测序时扩增所用扩增试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应的 Ion PI? Template 0T2200Kit V3试剂盒。
[0030] 步骤(6)中测序时测序所用测序试剂盒为Ion Proton第二代超高通测序仪对应的 Ion PI? Sequencing 200Kit V3试剂盒。
[0031] 所述样本为稻田广食性捕食天敌的样本。
[0032] 与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
[0033]稻田生态系统中存在大量的节肢动物种类，这些种类特别是广食性天敌对稻田害 虫有着重要的控制作用；传统方法上，对天敌猎物谱的研究基本在于田间观察、笼罩实验、 猎物蛋白特异性单克隆抗体检测和普通或定量PCR检测。本方法以稻田系统中广食性捕食 天敌为研究对象，基于宏基因组学的研究思路，采用本方法所述的序列，建一个库最多可对 48个样本同时进行超高通量测序，进行基于宏条形码的稻田生态系统中捕食天敌猎物谱的 分析及田间生物多样性的研究，为保护天敌，促进生物防治提供基础，也为各种生态系统中 捕食者猎物谱的研究提供参考方法。
【附图说明】
[0034]图1是实施例4中1~24号样本PCR扩增产物电泳检测结果图；
[0035]图2是实施例4中25~48号样本PCR扩增产物电泳检测结果图。
[0036] 其中，Μ表示DNA Marker，条带从下往上大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2500bp。
【具体实施方式