用于定量检测rprm基因dna甲基化试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明的属于生物技术领域，具体涉及用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化试剂盒 及方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化作为最基本的表观遗传学调控机制，是肿瘤中最常见的基因分子改变 之一，尤其表现在肿瘤抑制基因与错配修复基因上，能导致基因编码区的突变和使基因失 活而有利于肿瘤的发展，是癌症发生的重要指标之一。人类不同类型的癌症基因甲基化模 式图谱的建立是相关领域研究的一项重要内容。目前已在肺癌、胃癌、头部和颈部癌症、膀 胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、和胆囊癌等中发现基因的异常甲基化。
[0003] RPRM基因的全称：reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate， 是一种p53肿瘤抑制因子诱导表达的基因，位于染色体2q23位点上，该位点等位基因失衡已 被证明与肺癌、乳腺癌和结肠癌等相关联。在许多癌症和肿瘤细胞株的检测中，都发现了 RPRM基因的异常甲基化，包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、淋巴 瘤、白血病、乳腺癌患者。特别是在早期胃癌的血浆样品检测中，只有RPRM有高甲基化频率 (> 70%)，而正常的对照血浆无明显的经常性甲基化，说明发现于癌症的RPRM甲基化，很少 发生在非恶性的组织中。因此，RPRM甲基化作为胃癌早期血清学活检的生物标志物是有潜 力的。另一方面，胃癌患者RPRM甲基化检测并与胃黏膜萎缩标记和幽门螺杆菌检测相结合 有可能建立起胃癌早期检测的指标。此外，由于RPRM甲基化是胃癌患者的重要指标之一，有 可能用于胃癌的预后检测中。目前RPRM甲基化检测已在美国被批准进入临床试验阶段。因 此，RPRM基因甲基化，作为癌症诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一 项重要参考依据。
[0004] 基因甲基化主要发生于CpG位点的C(即胞嘧啶）上，在重亚硫酸盐的作用下，胞嘧 啶将转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，再进一步通过DNA测序分析等方法，区 别胞密啶及尿密啶。因此，通过重亚硫酸盐转化可以区别胞嘧啶的甲基化或者非甲基化。本 发明，改进了重亚硫酸盐转化的方法，并通过建立甲基化修饰及非修饰内参质粒，配合实时 PCR的方法及阈值截取，将重亚硫酸盐转化PCR方法加以优化，进行DNA甲基化敏感的熔解曲 线分析，达到对DNA甲基化进行定量检测的目的。该方法不仅可用于定量检测RPRM基因 DNA 甲基化，也可用于定量检测其他基因 DNA甲基化，且免除了 DNA测序的步骤，而且对甲基化的 程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常适合于未来大量样本的高通量分 析。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化试剂盒及方法，该方法 不仅可用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化，也可用于定量检测其他基因 DNA甲基化，且免除 了 DNA测序的步骤，而且对甲基化的程度可以加以定量分析，操作较为简便，成本较低，非常 适合于未来大量样本的高通量分析。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化试剂盒，包含:DNA转化试剂组分(重亚硫酸盐转化反 应液），DNA纯化试剂组分(玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱 缓冲液），甲基化检测试剂组分（2 X SYBR GREEN I预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基 化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒Su)。
[0007] 用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化的方法，所述方法包括如下： (1)在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后加入 80微升重亚硫酸盐转化反应液，进行DNA转化反应;将上述转化反应后100微升的DNA溶液， 进行如下纯化处理。
[0008] (2)将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，通过玻璃纤 维膜离心柱收集转化后的DNA，并用漂洗缓冲液进行清洗;离心弃去漂洗缓冲液，加入脱硫 缓冲液进行脱硫处理，用漂洗缓冲液再清洗两次;离心弃去漂洗缓冲液，然后用30微升洗脱 缓冲液收集玻璃纤维膜离心柱上经处理后的DNA。
[0009] (3)取上述纯化后的DNA溶液1微升转移到0.1毫升的PCR管中，在含1 XSYBR GREEN I预混反应液，0.25微摩尔/升RPRM-F、RPRM-R引物的反应液中进行实时聚合酶链式反应扩 增;条件如下：扩增阶段:95°C、30秒；[95°C、5秒，56°C、15秒，72°C、30秒]40个循环;熔解 曲线阶段:95°C、15秒，然后从72°C_88°C每升高0.1°C读取一次荧光值，将得到的结果进行 熔解曲线法分析，以确定样本中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
[0010]步骤(3)中的熔解曲线法分析使用两种标准质粒作为参照：甲基化的RPRM基因序 列经重亚硫酸盐转化后的M-seq，序列为SEQ ID NO. 2，而非甲基化序列转化后U-seq，序列 为SEQ ID N0.3,然后分别将这两种序列克隆至载体上作为阳性对照标准样品SM和Su，进行 上述(3)所描述的实时PCR扩增及熔解曲线分析。
[0011] 具体为： 用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化试剂盒，包含:DNA转化试剂组分(重亚硫酸盐转化反 应液），DNA纯化试剂组分(玻璃纤维膜离心柱，结合缓冲液，漂洗缓冲液、脱硫缓冲液，洗脱 缓冲液），甲基化检测试剂组分（2 X SYBR GREEN I预混反应液，引物RPRM-F与RPRM-R，甲基 化阳性对照质粒SM及非甲基化阳性对照质粒SU)。
[0012] 所述DNA转化试剂组分中，重亚硫酸盐转化反应液含5摩尔/升NaHS03，12.5wt.% 乙二醇二甲醚(DME)，pH 5.0。
[0013] 所述DNA纯化试剂组分中，结合缓冲液含6摩尔/升盐酸胍;漂洗缓冲液含10毫摩 尔/升Tris-Cl，pH 6.8,体积分数80%乙醇;脱硫缓冲液含200毫摩尔/升NaOH，100毫摩尔/升 NaCl，体积分数30%乙醇，体积分数5%甘油;洗脱缓冲液含10毫摩尔/升Tris-Cl，1毫摩尔/升 EDTA，pH 8.0。
[0014] 所述的引物RPRM-F为：5 ' -GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG-3 ' ； RPRM-R为5 ' -CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3,〇
[0015] 所述的2XSYBRGREENI预混反应液含有2毫摩尔/升MgC12、100毫摩尔/升Tris-Cl，l个酶活力单位/微升Taq DNA聚合酶，5毫摩尔/升dNTPs，2XSYBR GREEN I染料和2X ROX I校准染料。其中2XSYBR GREEN I染料、2XR0X I校准染料购买自北京博凌科为生物 科技有限公司。
[0016]用于定量检测RPRM基因 DNA甲基化的方法，包括如下： (1 )DNA重亚硫酸盐转化反应： 在0.2毫升的PCR管中，加入含有1纳克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后与80微升 转化反应液混匀;将PCR管置于热循环仪中进行如下反应：95°C 3分钟预变性；[95°C 30 秒，70°C 10分钟]12个循环。
[0017] (2)DNA 纯化处理： 将上述转化反应后100微升溶液，与500微升结合缓冲液进行混合，然后全部转移至玻 璃纤维膜离心柱中，12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液， 12000转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入250微升脱硫缓冲液，室温放置10分钟，12000 转/秒转速离心1分钟；弃去流出液，加入500微升漂洗缓冲液，12000转/秒转速离心1分钟， 然后再重复此步骤一次；12000转/秒转速离心2分钟彻底甩去残留的漂洗缓冲液，然后将离 心柱转移至新的1.5毫升Eppendorf管中；加30微升洗脱缓冲液，室温放置2分钟，然后12000 转/秒转速离心1分钟收集纯化后的DNA。
[0018] (3)PCR反应及MS-MCA(Methylation_sensitive Melt Curve Analysis)分析： 在0.1毫升的荧光定量PCR管中，加入8微升超纯水，10微升2XSYBR GREEN I预混反应 液，浓度为10微摩尔/升RPRM-F和RPRM-R引物各0.5微升，最后加入1微升上述纯化的DNA，混 勾。然后将PCR管置于荧光定量PCR仪中进行如下反应：扩增阶段:95°C 30秒预变性；[95 °C 5秒，56°C 15秒，72°C 30秒]共40个循环;熔解曲线阶段:95°C 15秒预变性，然后从72 °C_88 °C每升高0.1 °C读取一次荧光值，将得到的结果进行熔解曲线法分析，以确定样本 中RPRM基因启动子特异DNA序列甲基化的程度。
[0019] ⑷阳性对照： 在上述(3)的分析中，需要在另外的荧光定量PCR管中使用两种标准质粒Sm和Su作为参 照。人基因组RPRM祀基因序列（SEQ ID No.l，Ref-seq)，完全甲基化的基因组DNA经重亚硫 酸盐转化后相应的序列（SEQ ID No.2, M-seq)，以及非甲基化的基因组转化后相应的序列 (SEQ ID No.3, U-seq)如下： SEQ ID No.l, Ref-seq： gctttagaagagcctagctgctgcgcgcgtcggagaggctcctgggaaactcccacggcccagggactttcga aagcagagcgaggagccctcgcacgcgctagtctgcgagtgagcgctcagcccggcacctgttcctccagcgccgcc gccttcccacccctcggacccgcgccgctcgcggcgcccgcccgttcctgcgatgaatccggccctaggcaaccaga cggacgtggcgggcctgttcctggccaacagcag SEQ ID No.2， M_seq，SM: gttttagaagagtttagttgttgcgcgcgtcggagaggtttttgggaaatttttacggtttagggattttcga aagtagagcgaggagttttcgtacgcgttagtttgcgagtgagcgtttagttcggtatttgtttttttagcgtcgtc gtttttttatttttcggattcgcgtcgttcgcggcgttcgttcgtttttgcgatgaattcggttttaggtaattaga cggacgtggcgggtttgtttttgg