基于FSHβ基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子育种领域，尤其涉及一种基于FSffi基因的猪繁殖性状相关的 分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性 状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实 现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
[0003] 总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经 济效益。
[0004] FSH在动物HPG生殖轴中可能诱导雄性动物曲精细管生长、维持精子生成、刺激睾 丸间质细胞发育和刺激雌性动物的卵泡发育、促进子宫内膜生长，还协同LH刺激性腺激素 的合成与分泌，促进卵泡成熟、排卵。猪FSffi基因被定位于2pl.6-pl.2,包括3个外显子和2 个内含子。FSffi基因被认为是影响繁殖性能的一个重要的候选基因。关于FSH0基因多态性 与繁殖性状的关联分析主要集中在人、猪、羊、牛上。这些结果提示FS?基因可能是一个控 制繁殖性能的主效基因，或与主效基因呈现紧密连锁状态。在猪上，FSffi基因第1内含子中 的一个插入突变成为研究热点，越来越多的研究显示，等位基因 A(插入突变)在中国地方猪 中占优势，而等位基因 B(缺失突变)在外来猪中占优势，但是关于该位点对猪繁殖性能的作 用，研究品种不同，结论也不尽相同。而FS?基因其它区域的研究不多。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于FSffi基因的猪繁 殖性状相关的分子标记，为猪的分子育种提供新的思路，本发明的另一个目的是提供所述 分子标记的检测方法和应用。
[0006] 技术方案:本发明所述的基于FS?基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪FSH β基因片段，所述的猪FSM基因片段含有突变位点，突变为猪FSM基因核苷酸序列的 8942bp-8954bp处存在的1 lbp的碱基片段的插入/缺失。
[0007] 猪FSHβ基因的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，突变SEQIDN0.4所示序列的 8942bp-8954bp，处于所述的突变位点，与猪总产仔数、产活仔数紧密相关，易于检测，可利 用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。
[0008] 本发明所述的猪FSffi基因片段如SEQ ID N0.1所示。当然，本发明所述的猪FSffi基 因片段也可以为包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的DNA片段。根据检测方法，可以选 择合适长度的能够包含突变位点的DNA片段。
[0009] 本发明还提供了所述分子标记的检测方法，包括：
[0010] (1)根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
[0011] (2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0012 ] (3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
[0013]步骤(3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
[0014]优选的，步骤（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，下游引物的核苷 酸序列如SEQ ID N0.3所示。利用该引物可直接进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖或聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行基因分型检测。
[0015] 本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
[0016] 具体的，猪可以为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018]本发明研究发现，猪FSffi基因第3外显子存在一个突变位点，该突变为llbp碱基的 插入/缺失，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，从 而本发明根据该突变位点提供了一种基于FSffi基因的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供 了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理 机制提供基础。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例1中PCR扩增产物PAGE凝胶分型结果；
[0020] 图2为实施例1中GG和HH基因型个体PCR产物测序结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0022] 实施例1
[0023] 2013年采集106头小梅山猪、42头楓泾猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏农 林职业技术学院小梅山猪育种中心2004年~2012年期间上述106头小梅山母猪的生产档 案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样(约0.15g)用耳号 钳采集，_20°C冻存。用常规的酚氯仿抽提法提取猪基因组DNA，对基因组DNA进行0D值测定， 计算其浓度，并用ddH20稀释至终浓度为lOOng/yL，原液-20 °C保存，稀释液4°C保存，稀释液 作为PCR扩增的模板。
[0024] 第一步:根据GenBank公布的猪FSHI3基因全序列（登录号:D00621.1)，采用混合基 因池技术，扩增猪FSH0基因3个外显子，测序后发现猪FSffi基因8942bp后的序列上每个碱基 位置出现1-2个峰，提示:在8942bp后的序列上可能发生缺失或插入现象。其中，混合基因池 技术中，将每个个体基因组DNA样本吸取5yL进行混合，形成DNA池，作为扩增模板，所采用的 扩增引物为：上游引物F: agcctccaacatcttctt，下游引物R: attcaatgcctgtctcat。扩增体系 为为20yL，包括：10XBuffer 2.0yL、25mM Mg2+2.2yL、10mM dNTPs 0·8μL、10μΜ上、下游引物 各叫1^、0嫩模板叫以100即）、51]11/^^9酶0.2以1^、(1(1!120 11.8以匕？0財广增反应程序:94°(：预 变性 5min;31 个循环(94°C 变性 lmin，62°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin);最后 72°C 延伸 10min，4 °C保存产物。
[0025]第二步:采用Primer5.0软件设计1对引物，扩增该碱基缺失区域。引物为:FSffi-3(161。上游引物序列为：5'-&七&8&(^(3(^&1：(31：(3(^&&1：-3'，下游引物序列为：5'- gactggccctgctcttgtag-3'，扩增区域为8917bp-9158bp(SEQIDN0·l)，扩增产物长度 242bp〇
[0026] 第三步：？0財广增。？0財广增反应体系为2(^1^，包括：10\81^€612.(^1^，25111]\11^ 2+ 2.2yL，10mM dNTPs 0·8μL，10μΜ上、下游引物各lyL，DNA模板lyL(100ng)，5U · yL-^aq酶0.2 yL，ddH20 11.8yL。PCR扩增反应程序:94 °C预变性5min; 31个循环(94 °C变性lmin，60 °C退火 30s，72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行基因分型检测，基因型分型结果见图1，图1中，泳道3、7的基因型为GG，泳道4、5的基因 型为HH，泳道1、2、6、8、9的基因型为6!1肩为1&^1?^。
[0027] 第四步:将GG和HH基因型个体的PCR扩增产物送上海生工生物公司进行测序，测序 结果见图2。
[0028]第五步:分析该位点在不同猪群中的分布情况。结果见表1，大白猪群体中只检测 到1种基因型，即GG，说明等位基因 G在大白猪群体中已经固定下来;等位基因 G在小梅山猪 与楓泾猪2个猪群中的基因频率分别为0.580、0.357，x2检验结果表明，2个猪群在FSHi3-3.2 位点上均处于哈代-温伯格平衡状态(P值分别为0.652、0.911;P>0.05)。
[0029] 表1 3个猪群FSH0基因第3外显子llbp碱基缺失位点的基因型频率与等位基因型 频率
[0030]
[0031]第六步:SPSS软件关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。结果见表2,1~2胎 小梅山母猪中，HH型个体的TNB为12.09头，比66、6!1型个体分别高1.24头(？〈0.01)、0.35头 (P>0.05)，HH型个体的NBA最高，为11.25头，但3种基因型个体的NBA差异不显著(P>0.05) ;2 胎以上小梅山母猪中，HH型个体的TNB为13.16头，显著高于66、6!1型个体(？〈0.05)，66与6!1 型个体的TNB差异不显著(P>0.05)，3种基因型个体的NBA差异均不显著(P>0.05);所有胎次 的小梅山母猪中，HH型个体的TNB显著高于GH型个体(P〈0.05)，极显著高于GG型个体(P〈 0.01) ;HH型个体的NBA显著高于GG型个体(P〈0.05)，与GH型个体差异不显著(P>0.05); 3个 阶段中，3种基因型个体的TNB与NBA均表现出相同的趋势:HH>GH>GG。
[0032]表2 FSffi基因 llbp-del位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
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[0034]注:N为窝数;TNB为总产仔数;NBA为产活仔数
[0035] 结果提示：猪FSH0基因 llbp-del位点上，纯合子HH的繁殖性能优于杂合子和纯合 子GG的繁殖性能，其加性效应并能在世代更递中固定下来，另外，大白猪中缺少Η基因，可能 这是品种特性所导致的，因此在选种中应加强Η基因和ΗΗ基因型的选择。
【主权项】
1. 一种基于Fsro基因的猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪Fsro基因片 段，所述的猪FSffi基因片段含有突变位点，突变为猪FSH0基因核苷酸序列的8942bp-8954bp 处存在的llbp的碱基片段的插入/缺失。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSffi基因片段包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSM基因片段如SEQ ID NO. 1所示。4. 一种根据权利要求1~3任一项所述的基于FSHi3基因的猪繁殖性状相关的分子标记 的检测方法，其特征在于，包括： (1) 根据权利要求1~3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物； (2) 以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增； (3) 判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. -种根据权利要求1~3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
【专利摘要】本发明公开了一种基于FSHβ基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述的分子标记为猪FSHβ基因片段，所述的猪FSHβ基因片段含有突变位点，突变为猪FSHβ基因核苷酸序列的8942bp-8954bp处存在的11bp的碱基片段的插入/缺失。本发明研究发现，猪FSHβ基因第3外显子存在一个突变位点，该突变为11bp碱基的插入/缺失，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，本发明根据该突变位点提供了一种基于FSHβ基因的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105567859
【申请号】CN201610144670
【发明人】吴井生, 陈永霞, 郭苹, 陈超
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月14日