利用prss2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法

文档序号:9804662阅读:553来源:国知局
利用prss2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乳蛋白含量分子标记的检测方法,特别涉及一种利用PRSS2基因 作为乳蛋白含量分子标记的检测方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异一A,T,C或是G的变异从 而引起DNA序列的改变,造成不同物种之间染色体基因组的多态性。这种基因组上的单个核 苷酸的变异(包括置换、颠换、缺失、插入)形成的遗传标记,其数量较多,多态性也很丰富。 一般来说,SNP是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在基因组DNA中任何碱基均有可能发 生变异,因此SNP既有可能在基因序列即在编码区内,也有可能在非编码序列上。但出现在 编码区的cSNP(coding SNP)相对较少,其变异率仅仅是非编码区变异的1/5,但对于cSNP在 遗传学的研究中是非常重要的。从对生物的遗传性状的影响上来看,cSNP分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP(non_synonymous cSNP),同义cSNP是指SNP所造成的编 码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列的改变,而非同义cSNP是指碱基序 列的改变造成翻译的蛋白质氨基酸序列的改变,从而影响蛋白质的功能。在人类的基因组 中大约每1000个碱基就有一个SNP位点,同时分布广泛,适于快速、规模化筛查,易于检测和 基因分型等,因此SNP成为第三代遗传标记,充分在动物遗传、群体遗传研究、基因定位及基 因育种,以及关联分析等方面发挥着重要的作用。同时也在分子遗传、药物药理、疾病的诊 断和治疗等方面发挥着重要作用。
[0003] SNPs的检测主要有DNA直接测序,PCR-RFLP,以及单链构象多态技术(SSCP)等。其 中,DNA直接测序的方法简单、准确,很适合大群体样本的检测。
[0004] PRSS2(protease,serine,2)基因是属于胰蛋白酶家族中以丝氨酸为活性中心的 重要的蛋白水解酶,在生物有机体中发挥着广泛重要的作用,通过对蛋白酶原的激活或是 抑制而进行调节,编码阴离子胰蛋白酶原。又称为TRYP8,是由胰腺合成的最丰富的分泌蛋 白之一。它与阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)数量的比值是1:2。丝氨酸蛋白酶超家族的成员较 多而且分布较广,他们的活性部位都含有3虹,把 84叩,但是它们与底物的结合部位的差异 决定了各自对底物的专一性,正是因为在结构上的微小变化造成了功能上的差异。有研究 表明,丝氨酸蛋白酶在心血管疾病的治疗上也发挥了重要的作用。纳豆激酶具有纤溶活性 是由纳豆芽孢杆菌产生的,可直接作用于交联纤维蛋白,增加纤溶酶的活性。大部分的蛇毒 丝氨酸蛋白酶对凝血、纤溶系统起到重要作用。而从蚯蚓提取的蚯蚓纤溶酶有溶解血栓又 有抑制新血栓形成的作用。更有研究表明胰蛋白酶原2即PRSS2与多种恶性肿瘤密切相关, 也被称为肿瘤相关胰蛋白酶原(PRSS2),多种恶性的肿瘤细胞株都能表达该蛋白,其表达也 与肿瘤的侵袭和转移有关,PRSS2是基质金属蛋白酶(MMP)的激活物,能激活间质胶原酶,促 进肿瘤细胞的侵袭和转移。同时PRSS2蛋白能够激活蛋白酶激活受体,促进肿瘤的生长发 育。也有研究表明PRSS2与胰腺疾病有密切关系。因此研究该基因的功能好调控作用机制成 为遗传学研究的热点,进而对PRSS2基因的研究具有着重要的意义,目前对其在奶牛为对象 的研究还相对较少,而有关PRSS2基因与奶牛性状的相关性目前还少有报道。
[0005] 乳蛋白含量是作为乳品质分析的重要指标,一般来说乳蛋白含量高一点,乳品质 也就好一点。本发明利用PRSS2基因单核甘酸多态性及突变型来作为检测乳蛋白含量的分 子标记的方法,使其可以作为分子标记来衡量乳品质中乳蛋白的含量,为遗传工作者提高 乳蛋白含量及改善乳品质的研究奠定了基础。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是为了改良种群、提高牛乳品质,以功能的多态性位点作为育种标 记而提供的一种利用PRSS2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法。
[0007] 本发明提供的利用PRSS2基因作为乳蛋白含量分子标记的检测方法,其具体方法 如下:
[0008] 第一步;采取牛的血液进行全基因组DNA的提取,利用琼脂糖凝胶电泳的方法,检 查DNA的质量;
[0009] 第二步:以全基因组DNA为模板,以引物A为引物进行PCR扩增牛PRSS2基因片段;
[0010]
[0011] R:5 ' CGTAGCCCCAGGACACAAT 3,;
[0012] 第三步:用全基因组DNA进行混池 PCR,找到多态性的位点,PCR的反应程序为:95°C 预变性5min; 95°C变性30s,58°C退火30s,72°C延伸45s,35个循环;延伸72°C10min,最后16 °C保存;
[0013] 第四步:对单个样品进行测序,根据测序结果进行多态性关联分析:
[0014] 根据PRSS2引物对A的PCR测序结果,找到5个SNP位点分别在核苷酸序列上535bp处 存在G到A的突变,678bp处存在A到T的突变,715bpp处存在G到A的突变,725bpG到C的突变, 944bp处存在T到C的突变,分别是PRSS2基因第3内含子SNP 1,即:I3-265G>A突变位点, PRSS2基因第4外显子SNP 2,即:Ε4-31ΑΧΓ突变位点,PRSS2基因第4外显子SNP 3,即:E4-68G >A突变位点,PRSS2基因第4外显子SNP 4,即:E4-78G>C突变位点,PRSS2基因第4内含子SNP 5,即:I4-160T>C突变位点。
[0015] 本发明的有益效果:
[0016] 本发明通过对部分牛的全基因组DNA进行PCR混池扩增,并通过直接测序的方法检 测SNPs,发现了 5个SNP位点与牛的乳品质中乳蛋白性状的相关性。提供了一种简单,快速的 在DNA水平上筛查和检测与牛乳品质性状密切相关的遗传标记,可应用于牛的分子育种。解 决了 SSCP、PCR-PFLP技术的繁琐性,提高了准确性和精确度。同时,本发明也发现,这5个 SNP位点之间也具有着高度的连锁性。
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例中的奶牛PRSS2基因引物对A的PCR产物1.5%的琼脂糖凝胶电 泳图。
[0018] 图2为GA型PRSS2基因第3内含子SNP 1(I3-265G>A)突变位点测序检测图。
[0019] 图3为GG型PRSS2基因第3内含子SNP 1(I3-265G>A)突变位点测序检测图。
[0020] 图4为AA型PRSS2基因第3内含子SNP 1(I3-265G>A)突变位点测序检测图。
[0021 ] 图5为AT型PRSS2基因第4外显子SNP 2(E4-31A>T)突变位点测序检测图。
[0022] 图6为TT型PRSS2基因第4外显子SNP 2(E4-31A>T)突变位点测序检测图。
[0023] 图7为AA型PRSS2基因第4外显子SNP 2(E4-31A>T)突变位点测序检测图。
[0024] 图8为GA型PRSS2基因第4外显子SNP 3(E4-68G>A)突变位点测序检测图。
[0025] 图9为GG型PRSS2基因第4外显子SNP 3(E4-68G>A)突变位点测序检测图。
[0026] 图10为AA型PRSS2基因第4外显子SNP 3(E4-68G>A)突变位点测序检测图。
[0027] 图11为GC型PRSS2基因第4外显子SNP 4(E4-78G>C)突变位点测序检测图。
[0028] 图12为CC型PRSS2基因第4外显子SNP 4(E4-78G>C)突变位点测序检测图。
[0029] 图13为GG型PRSS2基因第4外显子SNP 4(E4-78G>C)突变位点测序检测图。
[0030] 图14为TC型PRSS2基因第4内含子SNP 5(I4-160T>C)突变位点测序检测图。
[0031 ] 图15为CC型PRSS2基因第4内含子SNP 5(I4-160T>C)突变位点测序检测图。
[0032] 图16为TT型PRSS2基因第4内含子SNP 5(I4-160T>C)突变位点测序检测图。
[0033]图17为PRSS2基因的5个SNP位点之间的强连锁效应图。
【具体实施方式】
[0034] 一、试验材料与方法:
[0035] 1实验材料:
[0036] 1.1试验动物:
[0037]以中国荷斯坦奶牛群体为检测对象,选用辽宁省某大型奶牛场奶牛,采用颈静脉 采血的方式进行样本的采集。
[0038] 1.2试验试剂:
[0039] 琼脂糖(BIOWEST); TAE、水焦磷酸二乙酯(DEPC),购自Sigma公司;PCR引物由上海 生物工程公司合成;DNA提取试剂盒、2XTaq PCR Master Mix均购自TIANGEN公
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