一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法。 技术背景
[0002] 尼帕病毒是一种新出现的人畜共患病毒(一种可由动物传播给人类的病毒）。尼帕 病毒给感染者造成严重疾病，特征为脑部炎症(脑炎)或呼吸系统疾病。该病毒还可在猪等 动物身上引起严重疾病，给养殖者造成重大经济损失。尼帕病毒属于RNA病毒，属亨德拉尼 帕病毒属，这是副粘病毒科的一种新病毒类别。狐蝠科的果蝠是尼帕病毒的天然宿主。感染 尼帕病毒的果蝠身上没有明显疾病，一旦感染人类，病死率极高，生物危害性极大，目前没 有疫苗或者特效药物用于治疗尼帕病毒感染。
[0003] 荧光PCR检测方法操作简便、检测时间短、结果判读不需要通过电泳、具有良好的 特异性和灵敏度。目前荧光PCR检测方法是分子生物学检测领域中应用最广泛的检测方法。
[0004] 尼帕病毒目前我国尚未传入，建立尼帕病毒荧光PCR检测方法对防控尼帕病毒具 有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种适用体外检测尼帕病毒的试剂，可以用于快速准确地检 测尼帕病毒。为此，本发明采用以下技术方案： 所述试剂包括特异性引物和探针，包括根据选择尼帕病毒的G基因的保守序列，设计一 对特异的引物及一条探针，引物和探针序列如下： 正向引物NIF: 5 ' -GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3 ' 反向引物NIR: 5 ' -CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3 ' 探针NIP: 5 ' FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3 '。
[0006] 探针的5'和3'端分别用FAM(羧基荧光素)和TAMRA(羧基四甲基罗丹明）标记。
[0007] 本发明第二个目的是提供运用上述试剂的体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，可 以快速准确地检测尼帕病毒。为此，本发明采用以下技术方案： 所述方法的反应体系为： lOXBuffer 2.5yL，2.5mM dNTPlmL，Taq酶lyL，AMV酶0.5yL，25mM Mg2S〇4 lyL，10mM正 向引物NIF和lOmM反向引物NIR分别1 yUlOmM探针NIP0.5 yL，模板1 yL，加入灭菌双蒸水 补足25仙； 所述方法包括以下步骤： 取阴性对照、阳性对照和待测样本各lyL分别置于所述反应体系中进行反应，混匀，置 于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水;95°C 3min预变性后，95°C 15s-60°C 20s，40个循环;结果判断采用以下方式： 在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35 者含有尼帕病毒，结果为阳性;未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结 果为阴性；如ct值大于35,且出现扩增曲线，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反 应，并按上述方式判断。
[0008] 本发明所提供的检测尼帕病毒试剂，其引物探针采用本发明所提供的体外荧光 PCR检测方法中的方案，利用上述方案建立的尼帕病毒荧光PCR检测方法具有操作简便，高 效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需1小时左右即可完成，填补了国内 检测尼帕病毒的空白。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明尼帕病毒灵敏度试验实时荧光扩增曲线图。
[0010] l：2.932X 109copies/yL, 2：2.932 X 108copies/yL,3：2.932 X 107copies/yL,4： 2.932X106copies/yL, 5：2.932X105copies/yL,6：2.932X 104copies/yL, 7 ： 2.932 X 103copies/yL, 8：2.932 X 102copies/yL,9：2.932 XlOVopies/yL,10：2.932 X10°copies/ yL〇
[0011] 图2尼帕病毒荧光定量PCR标准曲线图。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1尼帕病毒的检测 1.仪器和材料 7500荧光定量PCR仪和全自动核酸提取仪购自Life公司。引物、探针和质粒由北京中美 泰和生物技术有限公司合成，10 XBuffer、2.5mM dNTP、Taq酶、AMV酶购自北京美莱博医学 有限公司，1836核酸提取试剂盒购自Life公司。
[0013] 引物和探针设计 根据genbank数据库中的48株尼帕病毒序列，选择尼帕病毒的主要致病性蛋白--G蛋 白基因的保守序列做为目的基因，设计一对特异的引物(NIF和NIR)及一条探针(NIP)，引物 和探针序列如下： 正向引物NIF: 5 ' -GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3 ' 反向引物NIR: 5 ' -CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3 ' 探针NIP: 5 ' FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3 '。
[0014] 目的基因的构建 由于尼帕病毒未传入国内，采用人工合成目的片段的方法构建目的基因，尼帕病毒G蛋 白基因保守序列为目的片段，长度为254bp，插入质粒中，质粒全长为3119bp，转入大肠杆菌 培养，序列由北京中美泰和生物技术有限公司合成，序列如下： TTTGCATATAGCCACCTGGAAAGAATCGGATCATGTTCAAGAGGGGTCTCCAAACAAAGAATAATAGGAGTTG GAGAGGTACTAGACAGAGGTGATGAAGTTCCTTCTTTATTTATGACCAATGTCTGGACCCCACCAAATCCAAACACC GTTTACCACTGTAGTGCTGTATACAACAATGAATTCTATTATGTACTTTGTGCAGTGTCAACTGTTGGAGACCCTAT TCTGAATAGCACCTACTGGTCCGGATC 4.扩增的反应体系与反应条件 所述方法的反应体系为：10 XBuffer 2 · 5yL，dNTP(2 · 5mM)lmL，Taq酶lyL，AMV酶0 · 5yL， 25mM Mg2S〇4 lyL，正向引物NIF和反向引物NIR(lOmM)分别 1 yL，探针NIP(10mM)0.5 yL，模 板1 uL，加入灭菌双蒸水补足25μΜ混匀，置于荧光定量PCR仪中。95°C 3min预变性后，95 °C 15s-60°C 20s (荧光检测），40个循环。
[0015]灵敏度试验 提取的质粒浓度为lOOng/yL，根据公式:6.02 X 1023 X (质粒浓度ng/yL X 10-9 ) / (DNA片段长度X 660) = copies/yL计算出质粒的拷贝数原始值为2.932 Χ 101QcopiesAiL。10倍倍比稀释至2.932 X 10QcopiesAiL，按照上述扩增反应体系和反应条件 在荧光定量PCR仪上进行试验，记录实时荧光曲线，见图1。由此可见灵敏度在2.932 X lOVopies/yL左右，具有较高的灵敏度。绘制标准曲线，Y=-0.2987X+12.21，r2=0.999，可作 为定量检测参考依据。
[0016] 特异性试验 提取乙脑病毒疫苗、黄热病毒疫苗、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感 病毒、登革1型病毒等与尼帕病毒有类似症状的病毒核酸，采用上述反应体系及反应条件进 行试验，采用荧光定量PCR仪进行观察结果，具体结果见表1。除含尼帕病毒目的基因片段的 质粒外，其他病毒检测结果均为阴性。
[0017]表1尼帕病毒荧光PCR检测法特异性试验结果
7.样本检测 提取22份健康体检者血清核酸，采用上述尼帕病毒荧光PCR反应体系及反应条件进行 检测，结果除阳性对照外，其余均为阴性。表明该方法在阴性样本的检测中准确可靠。
【主权项】
1. 一种体外检测尼帕病毒的试剂，其特征在于所述试剂包括特异性引物和探针，其序 列如下： 正向引物NIF: 5 ' -GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3 ' 反向引物NIR: 5 ' -CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3 ' 探针NIP: 5 'FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3 '。2. -种体外焚光PCR检测尼帕病毒的方法，其特征在于， 所述方法的反应体系为： lOXBuffer 2.5yL，2.5mM dNTPlmL，Taq酶lyL，AMV酶0.5yL，25mM Mg2S〇4 lyL，10mM正 向引物NIF和lOmM反向引物NIR分别1 yUlOmM探针NIP0.5 yL，模板1 yL，加入灭菌双蒸水 补足25仙； 所述方法包括以下步骤： 取阴性对照、阳性对照和待测样本各lyL分别置于所述反应体系中进行反应，混匀，置 于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水;95°C 3min预变性后，95°C 15s-60°C 20s，40个循环;结果判断采用以下方式： 在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35 者含有尼帕病毒，结果为阳性;未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结 果为阴性；如Ct值大于35,且出现扩增曲线，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反 应，并按上述方式判断。
【专利摘要】本发明提供了一种适用体外检测尼帕病毒的试剂，包括特异性引物和探针，引物和探针序列如下：正向引物NIF：5’-GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3’<b>，</b>反向引物NIR：5’-CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3’，探针NIP：5’FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3’？。本发明还提供了运用上述试剂的体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。本发明建立的尼帕病毒荧光PCR检测方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需1小时左右即可完成，填补了国内检测尼帕病毒的空白。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105567870
【申请号】CN201510869808
【发明人】吕沁风, 黄建可, 蔡玉峰, 吴忠华
【申请人】浙江国际旅行卫生保健中心
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月2日