快速检测羊痘病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测羊痘病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的 用于快速检测羊痘病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二者在快速检 测羊痘病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。
【背景技术】
[0002] 自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字 PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器 以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家 实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用 传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾 病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适 用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。
[0003] 与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不 同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP;Eiken，日本），RPA(RPA; Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增（strand displacement amplification，Becton Dickson, USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比 较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物），特异性相对较弱（能扩增很多条带），时间 仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。
[0004] 英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase 八11^|]^;!^1:;[011，1^^)被称为是可以替代?0?的核酸检测技术。以此为基础的丁\/丨51八1叩? 核酸扩增产品能够在15分钟内，37 °C -42 °C之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟 的为进行实时监控的体系（如TwistAmp_? exo试剂盒，real-time RPA)以及基于试纸条的 终点检测（TwistAmp ⑧ nfo 试剂盒，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test，LFS RPA)0
[0005] 实时荧光RPA(real-time RPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如 酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药 物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽 杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热 病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病 毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。
[0006] 对于试纸条RPA(LFS RPA)试验而言，只要温度能控制在37-42Γ之间就行，比如可 以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试 纸条LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该 技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下 及造血组织坏死病毒（IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及 黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。
[0007] 羊痘又名羊"天花"，是由羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。痘 病毒属包括三种病毒，分别为绵羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV)、山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV)以及牛瘰瘡皮肤病毒（lumpy skin disease virus，LSDV)。羊痘同时具有重大 的公共卫生意义，中国、瑞典以及印度都有人感染羊痘病毒的报道。发病羊的病症是羊体无 毛或者少毛的皮肤部位发生丘疹和疱疹，并伴随有动物的发热。该病被世界动物卫生组织 列为A类传染病，同时也被我国列为一类动物传染病。不同的动物品种以及毒株可以导致不 同的致死率，致死率大概为10 % -75 %之间，妊娠母羊极其容易发生流产的现象。羊痘病毒 感染的羊群生产力严重降低，毛皮品质也严重受到影响，造成极大的经济损失，大大影响羊 以及皮毛的国际贸易。痘病毒具有很强的宿主特异性，在自然条件下一般不会发生交叉感 染的现象。其中，绵羊痘病毒和山羊痘病毒呈现出世界性分布的特性，非洲、中东、北欧、地 中海地区均有该病的报道，中国的广西、黑龙江、贵州等地也有该病爆发的报道。因此，建立 一种快速、简单、特异、敏感的检测方法来检测羊痘病毒对于该病的防控起着关键的作用。
[0008] C.A.Balinsky等（Balinsky，C.A.，et al.,Rapid preclinical detection of sheeppox virus by a real-time PCR assay.J Clin Microbiol,2008.46(2):p.438-42.)公开了一种特异性的检测绵羊痘病毒，并同时检测山羊痘病毒和牛疙瘩皮肤病病毒的 real-time PCR检测法。该方法的缺点在于需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，该方 法需要较长的试验时间（大约1.5h)。
[0009] Murray等（Murray，L·，et al.,Detection of capripoxvirus DNA using a novel loop-mediated isothermal amplification assay.BMC Vet Res,2013.9:p.90.) 公开了一种快速检测痘病毒的新型环介导等温扩增法，该方法能同时检测绵羊痘病毒、山 羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒。通过LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条带，因 此该方法同样存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了 实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(65°C)， 检测时间较长(60min)。并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。
[0010] 本发明针对羊痘病毒的GPCR基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real-time RPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFS RPA检测试剂盒以实现快速检测羊痘病毒的目的， 据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测羊痘病毒。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定羊痘病毒的检 测方法及试剂盒。
[0012] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0013] 本发明发明人针对羊痘病毒的GPCR基因设计引物和探针。同时通过对来自于 GenBank 中的 X74443，L39878，EU267274，EU267273，AJ849636，FJ905304，AY560591 和 AJ563705的GPCR基因同源序列进行比对分析，进一步确定了羊痘病毒GPCR基因的保守区 域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的羊痘病毒。所有的引物和探针 都由生工生物(上海，中国）合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，通 过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强的扩增信号的引物 对与探针组合应用到本发明中。针对实时荧光RPA(real-time RPA)与试纸条RPA(LFS RPA， Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的 不同检测特点，本发明分别设计了用于实时荧光RPA以及试纸条RPA检测的引物和探针序 列，该两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。
[0014]本发明一种用于快速检测羊痘病毒的实时焚光RPA(real-time RPA)检测试剂盒， 包括有一对引物和一条探针，
[0015]其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
[0016] 上游引物：5'-CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0017] 下游引物：5'-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3'（SEQIDN0·2所示）
[0018] 探针：5 ' -TAAACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTG(FAM-
[0019] dT)A(THF)A(BHQl-dT)TCAAAGCTATGTTTTAC-P-3'（SEQ ID 从).3所示）。
[0020] 其中，BHQl-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋 喃连接子，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延 伸。
[0021] 在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓 冲液，醋酸镁以及ddH20。
[0022] 使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒检测羊痘病毒，优选的，反应体系如 下：反应体系如下：14.7 5yL的水解缓冲液，1.0 5yL的1 ΟμΜ上游引物，1.0 5yL的1 ΟμΜ下游引 物，0.3yL的10μΜ探针，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸镁；
[0023] 扩增反应在温度设定为37-39 °C的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min_ lh，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
[0024] 更优选的，扩增反应在温度设定为