使用具有3’发夹结构的水解探针检测单核苷酸多态性的制作方法

文档序号:9816007阅读:491来源:国知局
使用具有3’发夹结构的水解探针检测单核苷酸多态性的制作方法
【专利说明】使用具有3 '发夹结构的水解探针检测单核苷酸多态性 发明领域
[0001] 本发明涉及基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断领域,而更具体地讲,涉及使用水解 探针的PCR检测方法。
[0002] 发明背景 PCR是复制或'扩增'DNA或RNA小区段的高效率并且成本节约的方式。使用PCR,仅在几 小时内就可制造出数以百万计的DNA部分的拷贝,得到分析所需的足够的DNA。此方法使得 临床医生可以使用最小量的样品(如血液或组织)来诊断和监测疾病。实时PCR使得扩增和 检测可以同时进行。一种检测方法是通过使用寡核苷酸水解探针(也称为TaqMan ?探针)完 成的,所述探针具有共价连接到例如该寡核苷酸探针5'端的荧光团和例如内部或3'端连接 的猝灭剂。水解探针是双重标记的寡核苷酸探针,其依靠 Taq聚合酶的5 '至3 '核酸外切酶 活性,在与互补靶序列杂交的过程中切割水解探针,并得到基于荧光的检测。
[0003] 实时PCR方法可被用于在具有单核苷酸多态性(SNP)的靶核酸中扩增和检测序列 变异。然而,许多现有的SNP检测/基因分型测定是基于SNP为双等位基因的假设(参见,例 如,Morita 等人,Mol .Cel. Probes, 2007,21,171-176)。用现有的实时 PCR 方法检测 SNP 缺乏足够的灵敏度和特异性。水解探针(如标准TaqMan ?探针)通常被设计成长约18至22 个碱基从而具有比引物高8-10°C的解链温度(Tm)。标准TaqMan ?探针一般经证明对于SNP 检测的特异性不高并且不太灵敏,而且不能够彻底区分WT(野生型)和MT(突变型)靶标。现 有的基于TaqMan?的SNP基因分型测定涉及使用TaqMan ? MGB(小沟结合剂,Minor Groove Binder)探针,该探针在长度上更短并且对于等位基因的区分具有增加的探针-模板结合稳 定性。额外的碱基修饰如稳定碱基(丙炔基dU、丙炔基dC)也可被包括在标准TaqMan ?探针 设计中用于改进的SNP检测和区分。因此,在本领域中需要一种以灵敏的方式特异性检测 SNP的快速而可靠的方法。
[0004] 发明概述 本公开的主题包括SNP特异性水解探针,其被设计成包含偏向3'端的发夹结构。此类水 解探针并不一定涉及使用额外的碱基修饰(如丙炔基dU、丙炔基dC)或特定分子(如MGB)。靠 近探针的3'端的发夹结构会延缓探针的3'部分与模板的杂交,并因而有助于根据报告基因 与靠近5 '端的猝灭剂之间的单个错配来区分WT和MT靶标。相比WT模板,SNP特异性探针的5 ' 部分可以更有效率地杂交至MT模板。当SNP特异性探针发现WT靶标时,与WT靶标的单个错配 可以防止杂交和探针切割,并因而不会检测到荧光。
[0005] 在一个方面,提供了用于检测样品中靶核酸的SNP的方法,该方法包括:进行扩增 步骤,包括使样品与包含第一核酸序列的引物接触,从而当样品中存在任何靶核酸时,产生 扩增产物;进行杂交步骤,包括使扩增产物与包含第二核酸序列的SNP特异性水解探针接 触,所述第二核酸序列与扩增产物的含有SNP的区域互补,所述SNP特异性水解探针包含第 一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹结构,所述发夹结构包含含 有一个或多个非天然存在的(例如,改变的或额外的)核苷酸的非天然存在的核酸序列区域 以产生所述发夹结构;以及检测扩增产物存在与否,其中存在扩增产物表明在靶核酸靶标 中存在SNP,而其中不存在扩增产物表明在靶核酸靶标中不存在SNP。在一个实施方案中,第 一可相互作用的标记包含处于5'末端的供体荧光部分,并且第二可相互作用的标记包含在 水解探针上所述供体荧光部分的不超过5个核苷酸之内的对应的受体荧光部分。在某些实 施方案中,受体荧光部分为猝灭剂。在另一个实施方案中,扩增采用具有5'至3'核酸外切酶 活性的聚合酶。在另一个实施方案中,引物的第一核酸序列和/或水解探针的第二核酸序列 包含至少一个经修饰的核苷酸。在又另一个实施方案中,引物的第一核酸序列和/或水解探 针的第二核酸序列具有40个或更少的核苷酸。
[0006] 在另一个方面,提供了用于检测样品中靶核酸的SNP的试剂盒,其包含:至少一种 引物,其包含特异性产生所述靶核酸的扩增产物的第一核酸序列;和SNP特异性水解探针, 其包含与扩增产物的含有SNP的区域互补的第二核酸序列,所述SNP特异性水解探针包含第 一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹结构,所述发夹结构包含含 有一个或多个非天然存在的(例如,改变的或额外的)核苷酸的非天然存在的核酸序列区域 以产生所述发夹结构。在一个实施方案中,第一可相互作用的标记包含处于5'末端的供体 荧光部分,并且第二可相互作用的标记包含在水解探针上所述供体荧光部分的不超过5个 核苷酸之内的对应的受体荧光部分。在某些实施方案中,受体荧光部分为猝灭剂。在另一个 实施方案中,试剂盒还包含具有5'至3'核酸外切酶活性的聚合酶。在另一个实施方案中,弓丨 物的第一核酸序列和/或水解探针的第二核酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。在又另 一个实施方案中,引物的第一核酸序列和/或水解探针的第二核酸序列具有40个或更少的 核苷酸。
[0007] 在一个方面,提供了 SNP特异性水解探针,其包含与扩增产物的含有SNP的区域互 补的核酸序列,所述SNP特异性水解探针包含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以 及偏向3'端的发夹结构,所述发夹结构包含含有一个或多个非天然存在的(例如,改变的或 额外的)核苷酸的非天然存在的核酸序列区域以产生所述发夹结构。在一个实施方案中,第 一可相互作用的标记可以是偏向、靠近或处于5'末端的供体荧光部分,并且第二可相互作 用的标记可以是在水解探针上所述供体荧光部分的不超过5个核苷酸之内的对应的受体荧 光部分。在某些实施方案中,受体荧光部分为猝灭剂。在另一个实施方案中,水解探针的核 酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。在又另一个实施方案中,水解探针具有40个或更少 的核苷酸。
[0008] 除非另行定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本发明所属领域普 通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用 于实践或测试本发明,但仍然在下文中描述了合适的方法和材料。另外,所述材料、方法和 实施例仅为说明性的而非旨在限制。
[0009] 在以下的附图和说明书中描述了本发明的一个或多个实施方案的详细内容。从附 图和详细描述以及从权利要求书中,本发明的其它特征、目标和优点将会是显而易见的。 [00 10] 附图简述 图1示出了使用具有偏向3 '端的发夹结构的水解探针检测526N SNP的实时PCR扩增曲 线。
[0011]图2示出了在MT质粒(SEQ ID N0:5)和WT质粒(SEQ ID N0:6)的一部分上526N SNP (CAC/AAC)的位置以及没有发夹的探针(长箭头),该探针具有末端碱基替换以防止分子间 相互作用。
[0012] 图3示出了用于526N SNP位置的水解探针的序列(SEQ ID N0:1),所述探针被设计 成具有处于3'端的发夹结构并且有三个碱基被替换以形成该发夹。
[0013]图4示出了使用没有发夹结构的水解探针检测526N SNP的实时PCR扩增曲线。
[0014]图5示出了使用具有偏向3'端的发夹结构的水解探针检测531L SNP的实时PCR扩 增曲线。
[0015] 图6示出了在MT质粒(SEQ ID N0:7)和WT质粒(SEQ ID N0:8)的一部分上531L SNP (TCG/TTG)的位置以及没有发夹的探针(长箭头)。
[0016] 图7示出了用于531L SNP位置的水解探针的序列(SEQ ID N0:3),所述探针被设计 成具有处于3'端的发夹结构并且有一个碱基被替换以形成该发夹。
[0017] 图8示出了使用没有发夹结构的水解探针检测531L SNP的实时PCR扩增曲线。
[0018] 发明详述 本文描述了用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性(SNP)的方法、试剂盒和水解探 针。用于检测靶核酸的SNP的实时PCR相比其它方法在灵敏度上的提升,以及实时PCR的改进 特征(包括样品容量(sample containment)和对扩增产物的实时检测),使得将这项技术实 施用于在临床实验室中对靶核酸的SNP的常规诊断和检测变得可行。
[0019] 方法可包括进行至少一个循环步骤,该循环步骤包括在样品中使用一种或多种引 物或一种或多种引物对,扩增靶核酸分子的一个或多个部分,例如,含有待检测的所关注的 SNP的基因革巴标。如本文中所用,"引物"("primer"、"primers")和"引物对"指代寡核苷酸引 物,其特异性退火至核
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