大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及大豆蛋白GmAIRPI及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 盐碱、干旱等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。运些环境因子导 致植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引 起不可逆伤害，导致整个植株死亡。植物在长期的进化中，逐渐形成了一系列应答逆境胁迫 的防御机制，其中泛素/26S蛋白酶体途径是应答胁迫的一个重要途径。泛素连接酶E3决定 祀蛋白的特异性识别，在泛素化过程中具有至关重要的作用。
[0003] 大豆是我国重要的经济作物和粮食作物，干旱、盐碱等非生物胁迫导致其产量和 品质均大大下降，既不能满足国内人民生活的需求，也极大限制了大豆的出口。探究泛素/ 26S蛋白酶体途径在大豆抵御非生物胁迫中的功能与作用机制、挖掘相关调苄基因，将有助 于推动大豆抗逆遗传育种。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供大豆蛋白GmAIRPI及其编码基因。
[0005] 本发明提供的蛋白，命名为GmAIRPI，是如下1)或2):
[0006] 1)序列表中序列2所示的蛋白质；
[0007] 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
[000引上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009]编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0010] 上述DNA分子是如下1 )-3)中任一种的DNA分子：
[oow 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[001^ 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[001引 3)与1)限定的DNA序列至少具有70 %、至少具有75 %、至少具有80 %、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99 %同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0014] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0015] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的 范围。
[0016] 上述重组载体为将序列表中序列1所示的GmAIRPI基因替换表达载体PBI121的 BamHI和Sac I酶切位点间DNA片段得到的载体，命名为地1121 -GmA IRP1。
[0017] 扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[001引上述蛋白、上述DM分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控 植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围；
[0019]或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培 育抗逆性提高转基因植物中的应用。
[0020]上述应用中，所述抗逆性为抗盐性;上述调控为提高。
[0021 ] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0022] 所述双子叶植物具体为烟草。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高转基因植物的方法。
[0024] 本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植 物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
[0025] 上述方法中，所述抗逆性为抗盐性。
[0026] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0027] 所述双子叶植物具体为烟草。
[00%]上述转基因植物的抗盐性高于所述目的植物体现在高盐胁迫下，转GmAIRPl烟草 的POD或CAT含量高于野生型烟草；或转GmAIRPl烟草的MDA含量低于野生型烟草；或转 GmAIRPl烟草长势优于野生型烟草。
[0029] 本发明的实验证明，本发明克隆了一个新基因 GmAIRPl,将其转入烟草中，得到转 GmAIRPl烟草，用高盐胁迫条件处理转GmAIRPl烟草和野生型烟草，转GmAIRPl烟草长势优于 野生型烟草;对两组植株的口00八41\104、脯氨酸含量测定结果显示，转基因植株清除自由 基和调节渗透压的能力总体高于野生植株，掲示GmAIRPl可能参与了植物的抗盐调控过程， 为培育抗盐性植物奠定基础。
【附图说明】
[0030] 图1为GmAIRPl基因的RT-PCR扩增结果。
[0031] 图2为100ymol/L ΑΒΑ诱导下GmAIRPl基因的表达模式。
[0032] 图3为200mmol/LNaCl诱导下GmAIRPl基因的表达模式。
[0033] 图4为农杆菌中重组质粒的PCR鉴定。
[0034] 图5为转GmAIRPl烟草的PCR产物电泳检测结果。
[0035] 图6为转GmAIRPl烟草的RT-PCR检测。
[0036] 图7为转GmAIRPl烟草的发育进程。
[0037] 图8为野生型烟草种子与转GmAIRPl烟草种子对比。
[003引图9为转GmAIRPl烟草盐胁迫下的表型分析。
[0039] 图10为200mmol/LNaCl处理下转GmAIRPl烟草和野生烟草中的P0D、CAT和MDA含量。
[0040] 图11为200mmol/LNaCl处理下转GmAIRPl烟草和野生烟草中的脯氨酸含量。
【具体实施方式】
[0041 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 合丰45大豆(不同株型大豆群体分布对产量形成的影响.大豆科学，2005,29(4): 6:34-637.);
[0044] 龙江981烟草(烤烟新品种龙江981的选育及其特征特性.中国烟草科学，2015,36 (4):18-23.)
[0045] 农杆菌菌株为EHA105(影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究. 热带生物学报，2012,3(1) :22-27.)
[0046] 植物表达载体质粒PBI121全长14肺，含有卡那霉素抗性，记载在如下文献中：致病 疫霉NLP家族基因 PITG_10839的克隆和功能分析.中国农业科学，2014,47(5):895-902。
[0047] MS培养基，1/2MS培养基，卡那霉素化an),头抱霉素(Cef)，利福平(Rif)、6BA，NAA 等。
[004引 RNA提取试剂盒RNApr邱pure Plant Kit、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA提 取试剂盒均购自天根生物有限公司；RNA反转录试剂盒First Strand cDNA Synthesis Kit 购自东洋纺生物有限公司；限制性内切酶BamHI和Sac I均购自肥B公司。ExTaq DNA聚合酶、 dNTP、氨节青霉素 (Amp)购自宝生物(大连)有限公司。
[0049] 实施例UGmAIRPl基因的克隆及表达模式
[(K)加]一、GmAIRPl基因的克隆
[0051 ] 利用primer premie;r5.0设计引物，并分别在引物5'端加上BamHI和SacI两个限制 内切酶识别位点，引物序列如下：
[005。 GmAIRPl-Pl:5'CGGGATCCATGGGCGGTTGCTGTTGT 3,
[0053] BamHI
[0054] GmAIRPl-P2：GGAGCTCTTATTCAATGGGAGGGTCG [0化引 SacI
[0化6] 提取合丰45大豆的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，用GmAIRPl-Pl和GmAIRPl-P2 进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0化7] PCR扩增产物电泳结果如图1所示，M:化2000分子量标准；1~8 :PCR扩增产物，得到 约64化P大小的目的条带。
[0化引将上述PCR扩增产物与PMD-19T simple载体连接，转化E.coli D册α，通过蓝白斑 筛选和PCR鉴定初步筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行测序，结果该PCR产物具有序列表中 序列1所示的核巧酸，序列表中序列1所示的基因命名为GmAIRPl,该基因的开放阅读框为序 列1第1-642位核巧酸，其编码的蛋白命名为GmAIRPl,该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列 2所示，该蛋白由213个氨基酸残基组成。
[0059] 二、GmAIRPl基因在逆境胁迫和激素诱导下的表达模式分析
[0060] 1、逆境胁迫
[0061] 将合丰45大豆种子播种于赔石中，在溫度为28°C的溫室中培养，当幼苗长至第Ξ 片Ξ出复叶时，进行各种处理。
[0062] (1)盐胁迫处理:在干燥的赔石中诱入含200mmol/LNaCl的化agland溶液，处理0~ 24h；
[0063] (2)ABA处理:在干燥的赔石中诱入含100ymol/L ΑΒΑ Hoagland溶液，处理0~2地。
[0064] 分别于0.化、化、1.化、3h、化、1化和24h取不同处理组的大豆叶片，用去离子水冲 洗，液氮速冻后于-80°C保存，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行RT-PCR。
[0065] 上述内参及目的基因引物