一种蛹虫草子实体杂聚多糖及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物活性物质及其制备方法和用途，具体是一种蛹虫草子实体中 杂聚多糖及其制备方法和降脂的应用。
【背景技术】
[0002] 屯、脑血管疾病是一种高发病率、高致残率、高病死率的疾病，其主要病理过程是在 血管壁病变的基础上，血液成分和(或)血流动力学改变，造成缺血性或出血性疾病。其病因 较多，其中一个重要的病因是动脉粥样硬化。
[0003] 高血脂是诱发动脉粥样硬化的主要因素之一。当体内胆固醇过高，特别是低密度 脂蛋白水平化化-C似及甘油立醋增高时，氧化的LDL贝阿被巨隧细胞吞隧，进而沉积在动 脉内皮下，引起内皮下变性，进而导致血小板在动脉内壁聚集，若同时伴有动脉壁损伤或胆 固醇转运障碍，则易在动脉内膜形成脂斑，最后，血管壁隆起、向官腔内突起形成粥样斑块。
[0004] 脂蛋白脂酶化化)是脂质代谢的关键酶，其由肝外实质细胞合成分泌入血，水解乳 糜微粒(chylomicron，CM) W及化DL上的甘油Ξ醋(Triglyceride, TG) ;LPL缺乏会引起CM 和VLDL水平增高。
[000引蛹虫草(Cordyceps militaris L. Link)又名北虫草、北冬虫夏草，其与冬虫夏草 属于同属真菌，不仅具有与冬虫夏草相近的生物活性，且易于人工培养，成为冬虫夏草极具 潜力的替代品。蛹虫草多糖是蛹虫草含量较高的生物活性物质之一，且具有类似于冬虫夏 草的生物学活性，例如:增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种功能。从蛹虫草中 制备多糖，并确定其生物学活性，可W促进蛹虫草的临床转化应用和经济价值，对蛹虫草的 综合利用具有重要意义。
[0006] 蛹虫草多糖的单糖组成、相对分子质量、糖巧键连接方式可对其生物活性产生重 要影响。水提醇沉法获得多糖的方法虽然工艺流程简单，但获得的多糖相对分子质量范围 广，组成成分复杂，既不利于多糖构-效关系的阐述，也不利于产品质量控制和后续临床转 化应用。
[0007] 近年来，先后有国内外研究者报道了蛹虫草提取液单独或联合用药的降脂和抗动 脉粥样硬化效果，但蛹虫草子实体多糖中具有抗动脉粥样硬化和降脂功能的多糖活性成分 及其结构和制备方法未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明针对W上不足之处，提供了一种蛹虫草子实体杂聚多糖及其应用，此杂聚 多糖可用于制备药物用于降低血浆总胆固醇、甘油Ξ醋和低密度脂蛋白胆固醇水平，提升 超氧化物歧化酶和脂蛋白醋解酶活性、提升血浆高密度脂蛋白水平。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种蛹虫草子实体杂聚多糖的提取 方法，包括W下步骤： 1)制备蛹虫草子实体粗多糖:采集蛹虫草子实体，阴干并粉碎，过筛；向粉碎的蛹虫草 子实体中加水，经冻融后超声处理，过滤得破壁蛹虫草子实体;破壁后的蛹虫草子实体加入 95%的乙醇回流浸提脱脂，过滤得固形物；向固形物中再加入蒸馈水，加热超声浸提，抽滤除 去残渣得上清液;上清液减压浓缩后加入95%的乙醇，置于0~4 °C过夜，离屯、，收集沉淀;收 集的沉淀经真空冷冻干燥，即得蛹虫草子实体粗多糖； 2)蛹虫草子实体多糖的纯化:蛹虫草子实体粗多糖经阴离子交换柱采用去离子水洗 脱和凝胶渗透色谱柱分离纯化，即可分离得到纯的蛹虫草子实体杂聚多糖，命名为TY258。 获得的TY258,采用凝胶色谱法测定其分子量，其特征为该多糖分子量为625.8 kDa; TY258由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和6-氧甲基甘露糖组成;各糖巧键的构成比例由甲基化分 析结果和核磁共振波谱(NMR)数据确定。NMR如附图1-5所示，数据归属如表格1所示。
[0010] 所得的蛹虫草子实体杂多糖TY258的核磁共振波谱(NMR)数据(见表1):
其中：Glcp为化喃型葡萄糖、Manp为化喃型氧甲基甘露糖、Galp为化喃型半乳糖;其中B -3，A - 322;该多糖简称TY258。
[0011] 蛹虫草子实体杂聚糖在制备降低血浆总胆固醇、甘油Ξ醋和低密度脂蛋白胆固醇 水平，提升超氧化物歧化酶和脂蛋白醋解酶活性的药物中的应用。
[0012] 蛹虫草子实体杂聚糖在制备降低血浆总胆固醇、甘油Ξ醋和低密度脂蛋白胆固醇 水平，提升血浆高密度脂蛋白水平的药物中的应用。
[0013] 本发明首次公开一种结构新颖的蛹虫草子实体杂聚多糖的制备方面W及其在降 脂和抗动脉粥样硬化方面的应用，为蛹虫草多糖的构效关系研究提供了详实的实施案例。 在本发明的实施例中，蛹虫草子实体杂聚多糖ΤΥ258可显著下调apoE(-/-)小鼠、U)LR (-/-)小鼠、豚鼠和Wi S tar大鼠血浆TC、TG、LDkC、MDA和0X-LDL水平，并上调皿kC、L化活性 和SOD活性;TY258亦可显著降低动脉粥样硬化模型apoE(-/-)小鼠和LDLR(-/-)小鼠肝脏和 主动脉弓内皮下脂质蓄积，起到抗动脉粥样硬化效果。此外，在制备方面，本发明的实施方 法中均采用了工业化生产中常用的离子交换和分子排阻色谱法，为该发明的转化奠定了基 础。
【附图说明】
[0014] 图1所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的1H(A)和DEPT(B)核磁共振图谱； 图2所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的1H-1H COSY图谱； 图3所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的服QC核磁共振图谱； 图4所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的HMBC核磁共振图谱； 图5所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的肥0SY核磁共振图谱； 图6所示为蛹虫草子实体杂聚多糖TY258对肝脏脂质蓄积的影响， 与空白组相比，胖<0.05;#胖<0.01;与模型组相比，冲<0.05;*冲<0.01; 图7蛹虫草子实体杂聚多糖TY258对主动脉弓脂质蓄积的影响，与空白组相比，#P< 0.05;#胖<0.01;与模型组相比，冲<0.05;*冲<0.01。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述： 实施例1:蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的制备及抗动脉粥样硬化的应用 提取制备本发明的蛹虫草子实体杂聚多糖TY258并验证其在载脂蛋白E敲除小鼠模型 上的降脂和抗动脉粥样硬化效果时，采取了下述各步骤： 1) 制备蛹虫草子实体粗多糖:采集蛹虫草子实体，阴干后用植物粉碎机粉碎，过100目 筛。向粉碎的蛹虫草子实体中加入10倍量的水，揽拌均匀，置于超低溫冰箱中-80°C冷冻12 小时。迅速投入80°C水浴锅中解冻，水浴2小时。然后500W超声处理30分钟，过滤得固形物为 破壁蛹虫草子实体。破壁后的蛹虫草子实体中加入95%乙醇回流2小时，料液比为1:5 (W/ V)，浸提脱脂及可溶性分子，过滤得固形物。向固形物中加入蒸馈水，料液比为1:10 (W/V)， 500W超声加热，溫度控制在85°C，提取时间为3小时，抽滤除去残渣得上清液。重复提取1次。 多次的上清液合并，减压浓缩得浓缩液。向浓缩液中加入4倍体积95%的乙醇，置于4°C过夜， 3000Xg，离屯、15分钟，收集沉淀。收集的沉淀经真空冷冻干燥即得蛹虫草子实体粗多糖。 2) 蛹虫草子实体多糖的纯化:蛹虫草子实体多糖先经DEAE-52纤维素阴离子交换柱， 采用去离子水洗脱，收集洗脱液，经浓缩、透析、冷冻干燥得蛹虫草子实体杂聚多糖半成品。 上述蛹虫草子实体杂聚多糖半成品再经S邱hadex G-200葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到 蛹虫草子实体杂聚多糖成品TY258。 3)蛹虫草子实体杂聚多糖TY258的降脂和抗动脉粥样硬化应用：SPF级载脂蛋白E敲除 (apoE-/-)小鼠，雄性，体重20±2 g。在实验条件下给予普通饲料适应性喂养1周，将实验动 物随机分为5组：空白组12只、模型组12只、TY258低剂量组12只、TY258中剂量组12只和 TY258高剂量组12只。除空白组外，均给予高脂饲料(配方:胆固醇1.25%、胆汁盐0.5%、猪油 10%、蛋黄粉10%、基础饲料78.25%);空白组给予普通饲料。喂养1个月后，各组在饲料不变的 情况下，按照0.2 mL/kg灌胃给予相应药物，空白组和模型组给予同体积的生理盐水，每天1 次，连续给药2个月。各组的受试药物及剂量如下： 空白组:0.2血/kg生理盐水； 模型组:0.2血/kg生理盐水； 低剂量组：12.5 mg/kg蛹虫草子实体杂聚多糖TY258; 中剂量组:25 mg/kg蛹虫草子实体杂聚多糖TY258; 高剂量组:50 mg/kg蛹虫草子实体杂聚多糖TY258。 实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉 采血0.8-1.0 mL，戊己比妥钢麻醉处死，分离血浆，-80 °C下保存备用；屯、脏注射冲洗残存 血液后，迅速摘取屯、脏和肝脏，分离主动脉弓至骼总动脉分叉处的整条主动脉，去除血管外 的脂肪和结缔组织，染色后进行镜检。所得血清样本检测总胆固醇(TC)、甘油Ξ醋(TG)、低 密度脂蛋白水平化化-C)、高密度脂蛋白水平(H