一种淋巴细胞分离管及其制备方法、淋巴细胞分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学领域的细胞分离技术，特别是设及一种淋己细胞分离管及其 制备方法、淋己细胞分离方法。
【背景技术】
[0002] 在临床医学检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常设及到细胞的分 离技术，从外周血液和各种体液(胸水、腹水、屯、包积液等）中分离单个核细胞是体外进行淋 己细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续 实验可靠性的重要环节。
[0003] 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)是参与机体 免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMCs主要包含淋己细胞和单核细胞，PBMCs中大部 分(80%~90%)为淋己细胞，对不同淋己细胞的分离、鉴别W及功能的研究对疾病的诊断 乃至治疗都有十分重要的临床意义。
[0004] 目前，普遍采用的是淋己细胞分离液通过密度梯度法实现细胞分离，在用分离液 分离外周血淋己细胞时，操作者需要非常"小屯、翼翼"的用微量移液器把血液平铺到分离液 上方，技术难度大，操作非常费时费力。不仅需要专业的指导操作，而且复杂的操作会导致 分离后获得的细胞数差异很大，结果一致性差。
【发明内容】
[0005] 本发明提出一种淋己细胞分离管及其制备方法、淋己细胞分离方法，其淋己细胞 得率高且精确度高。
[0006] 本发明的技术问题通过W下的技术方案予W解决：
[0007] -种淋己细胞分离管，包括管体，还包括置于所述管体内的分离胶体和分离液，所 述分离液在所述管体底部，所述分离胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方;在 25°C时，所述分离胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3,所述分离液的密度为1.0765- 1.0785g/cm3，且所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值在0.008-0.012g/cm3之间；所 述分离胶体在1400g-1800g离屯、力下能触变成液态凝胶;所述分离胶体的顶面为一斜面，所 述斜面与水平面的夹角为20-70°。
[000引优选地：
[0009] 所述斜面与水平面的夹角为30-60°。
[0010] 所述分离胶体包括W下重量份数的各组分:双环戊二締树脂:90-100份;二亚苄基 山梨醇(D;Lbenz;ylidene sorbitol，DBS) :0.05-1.8份;聚丙締酸钢:0.03-10份;细颗粒二氧 化娃:2-3.5份;聚乙二醇:0.5-0.8份;邻苯二甲酸二醋:5-40份;有机膨润±: 3-7份。
[0011] 所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值为O.Olg/cm3。
[0012] 在25°C时，所述分离胶体的密度为1.0672g/cm3,所述分离液的密度为1.0772g/ cm]。
[0013] 所述分离液的加入体积为所述淋己细胞分离管体积的6.7%-10%;所述分离胶的 加入质量与所述淋己细胞的体积的比值为0.1 g/ni-o. 2g/mL。
[0014] -种所述的淋己细胞分离管的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)在一个分离管中依次加入预定密度的分离液和分离胶体；
[0016] (2)将步骤（1)中的分离管放入采用定角转头的离屯、机中，设定离屯、力为1400g- 1800g，离屯、时间为3-5min;
[0017] (3)离屯、结束取出分离管后，得到所述的淋己细胞分离管。
[0018] 一种用所述的淋己细胞分离管进行淋己细胞分离的方法，包括如下步骤：
[0019] (1)在所述的淋己细胞中加入一定量的抗凝全血；
[0020] (2)将步骤(1)中的淋己细胞分离管放入采用水平转头的离屯、机中，设定离屯、力为 1400g-1800g，离屯、时间为 10-20min;
[0021] (3)吸取步骤(2)的淋己细胞分离管中的呈白膜条带的液体，洗涂后分离得到淋己 细胞。
[0022] 本发明的有益效果包括：用本发明的淋己细胞分离管来分离淋己细胞，其细胞得 率高，精确度也高。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明【具体实施方式】中的淋己细胞分离管的示意图；
[0024] 图2是采用本发明【具体实施方式】中的淋己细胞分离管分离PBMCs细胞的过程示意 图；
[0025] 图3是本发明【具体实施方式】中细胞得率与夹角的关系曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0027] 一种淋己细胞分离管，在【具体实施方式】中，如图1所示，该淋己细胞分离管包括管 体1，还包括置于所述管体内的分离胶体2和分离液4，分离液4在所述管体1底部，所述分离 胶体的密度小于所述分离液位于所述分离液上方；在25°C时，所述分离胶体的密度为 1.0655-1.0755g/cm3,所述分离液的密度为1.0765-1.0785g/cm3,且所述分离液与所述分离 胶体的密度相对差值在0.008-0.012邑八1113之间；所述分离胶体在1400邑-1800邑离屯、力下能 触变成液态凝胶;所述分离胶体的顶面为一斜面，所述斜面与水平面的夹角a为20-70°，在 图1的实施例中，夹角a为45°。
[002引在一些优选的实施例中：
[0029] 所述斜面与水平面的夹角为30-60°。
[0030] 所述分离液与所述分离胶体的密度相对差值为O.Olg/cm3。
[0031] 在25°C时，所述分离胶体的密度为1.0672g/cm3,所述分离液的密度为1.0772g/ cm]。
[0032] 所述分离液的加入体积为所述淋己细胞分离管体积的6.7%-10% (较优的是为 8%);所述分离胶体的加入质量与所述淋己细胞的体积的比值为0.1g/mk0.2g/mL(较优的 是0.13g/mL)。
[0033] 在上述的【具体实施方式】中，在分离液的上方加入一个可W固液转变的凝胶层（即 分离胶体），加血操作时可W "倾倒"在分离胶体上，操作非常简单，可W快速掌握使用。加入 全血进行细胞分离时，在1400g-1800g离屯、力下，分离胶体可W触变成液态的凝胶，且密度 大的分离液会反转上移到液态凝胶的上方，与淋己细胞混合在一层。
[0034] 淋己细胞的分离液采用公知的分离外周血淋己细胞的分离液，其将聚薦糖和泛影 酸钢按照一定比例混合，通过常规手段调整密度、渗透压、pH值等，经过除菌过滤后制成密 度在1.0765-1.0785g/cm3内的一个定值。为了形成合适的密度梯度，发明人优化了分离胶 体和分离液的密度关系，误差精确到万分之2g/cm3，通过大量实证实验表明：在25 °C时分离 胶体的密度为1.0655-1.0755g/cm3(优选1.0672g/cm3)，呈固体状，在一定的离屯、力下可W 流化触变成液态的凝胶，分离液密度为1.0765-1.0785g/cm3(优选1.0772g/cm3)，且分离液 密度大于分离胶体，相对差值在0.008-0.012肖八1113之间(优选0.01肖八1113)。实验发现，若分离 液或分离胶体的密度过高，则分离出的淋己细胞纯度偏低;若分离液或分离胶的密度过低， 则分离出的淋己细胞得率偏低。若分离胶体与分离液密度差值低于〇.〇〇8g/cm3会导致二者 分层效果差，大于0. 〇〇12g/cm3，分层效果好，但分离液又不能在离屯、后反转到分离胶体的 上方，运两种情况下细胞得率都降低。实验证明在分离胶体与分离液密度相对差值在 0.008-0.012g/cm3之间(优选0.01 g/cm3)时，不仅分层效果好，而且细胞得率高。
[0035] 为此，优选的分离胶体包括W下重量份数的各组分:双环戊二締树脂:90-100份； 二亚苄基山梨醇(DBS): 0.05-1.8份;聚丙締酸钢:0.03-10份;细颗粒二氧化娃:2-3.5份;聚 乙二醇:0.5-0.8份;邻苯二甲酸二醋:5-40份;有机膨润±: 3-7份;其中细颗粒二氧化娃的 平均粒度为0. 〇5-1μπι，邻苯二甲酸二醋优选邻苯二甲酸二戊醋。分离胶体在离屯、力作用下 流化，本发明设定固体的分离胶体的顶面为一斜面，该斜面与水平面保证一定的夹角，夹角 在20度-70度。实验发现，若夹角小于20度，在1400g-1800g的离屯、力下流化效果差，需要更 大的离屯、力才能触变固体的细胞分离胶体变成液态凝胶。而若增大夹角则需要更多的分离 胶体来制备分离管，成本上不经济且形态也不合适，分离效果没有改善反而下降，优选夹角 在30-60度。因此，制备淋己细胞分离管的离屯、机采用特定的定角转头离屯、机，而在分离淋 己细胞的时候，再转为使用水平转头的离屯、机，因分离胶体呈斜面，其受到的离屯、力不一 样，容易触发流化。
[0036] 在另一【具体实施方式】中，提供一种所述的淋己细胞分离管的制备方法，包括如下 步骤：
[0037] (1)在一个分离管中依次加入预定密度的分离液和分离胶体；
[0038] (2)将步骤（1)中的分离管放入采用定角转头的离屯、机中，设定离屯、力为1400g- 1800g，离屯、时间为3-5min;