一种低阶煤降解菌的筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物筛选和低阶煤降解，具体地说，设及一种低阶煤降解菌的筛选 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 低阶煤主要包括褐煤、风化煤、泥炭等，其特点是煤化程度低，水分和灰分含量高， 热值低，含有较多的腐植酸。微生物转化研究是煤炭加工利用的新领域，在我国尤为重要。 我国有丰富的煤炭资源，褐煤、风化煤及泥炭的储量和产量很大，尤其适用于煤炭的生物转 化。
[0003] 煤是由植物演变而来，其中含有大量类木质素类的物质结构，运也是某些微生物 能降解煤的关键所在，利用运些微生物对木质素与芳香族类化合物强降解能力及其所释放 的酶对类木质素结构的攻击转化，将对煤的组成结构及燃烧特性等多方面产生影响。煤化 阶段较短的煤属于低阶煤，其灰份含量较高，热值较低，较难利用。而运类煤的变质程度越 低，其中含有的类木质素结构就越多，就越可能被微生物及其酶作用而降解，因此褐煤、风 化煤、泥炭、石煤等低阶煤都可能被微生物降解。
[0004] 目前，常用的低阶煤微生物降解菌的筛选主要W固体表面溶煤、细胞外液溶煤及 细胞液溶煤的方法来筛选，如CN103724060A公开一种褐煤生物肥及其生产方法。通过对新 疆阜康市和沙湾煤矿区域煤样样品中进行低阶煤降解菌的筛选，获得具有较强液化活性的 菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得两DavidiellatassianaCGMCC No. 7440和灰平链霉 菌（Sl:reptomycesg;riseoplanus)CGMCC No.8194。通过对所获菌株进行形态特征及相应序 列测定分析，初步确定了其分类地位和属性，利用获得两种菌种降解低阶煤，W褐煤和賴杆 等农业下脚料作为辅料，制备获得降解褐煤生产生物有机肥。CN101823907A公开了一种从 风化煤中分离出具有降解风化煤使腐植酸含量增加的高活性菌株，W风化煤为底物进行降 解发酵，利用菌种在风化煤中的代谢活动，使腐植酸活性增加，通过微生物菌种分离步骤、 菌种培养步骤、发酵步骤、复混步骤和包装步骤，生产制成高活性腐植酸菌肥。而梁宏斌等 认为目前在煤降解菌种的选取上未有实质性进展，还没有找到效果显著且适应性强的廉价 菌种目前已报道的菌种对煤的降解能力十分有限，并且菌种在生长过程中需要加入大量营 养物质，运使得煤生物转化成本提高，制约了煤的微生物转化工业化进程(低阶煤的降解方 法，梁宏斌等，黑龙江科学，2011年第2卷第4期）。
[0005] 因此，本发明旨在提供一种通过筛选产木质素酶的活性，从而快速筛选低阶煤降 解菌的方法。
[0006] 木质素酶包括木质素过氧化物酶、儘过氧化物酶及漆酶。微生物新陈代谢过程中 分泌的胞外酶能够降解煤，目前发现参与降解的酶主要有过氧化酶、氧化物酶、漆酶、水解 酶和醋酶等。但也有研究报道认为:漆酶在微生物溶煤过程中不起关键作用(漆酶对微生物 溶煤作用的研究，崔志芳等，煤炭转化，第30卷第2期2007年4月）。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种低阶煤降解菌的筛选 方法及应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009] -种低阶煤降解菌的筛选方法，采集样品于培养基上培养，筛选产漆酶活性高的 菌株，然后在低阶煤培养基中堆腐，进行二次筛选，筛选到可降解低阶煤的菌株。
[0010] 此外，本发明所述方法为了使筛选得到的微生物能够适于实际应用，在培养基一 次筛选之后增加了在低阶煤中的二次筛选，从而保证了筛选得到的低阶煤降解菌在实际应 用中能够充分发挥其降解作用，弥补了现有技术中筛选到的微生物不一定能在实际应用 中发挥作用的不足。
[0011] 进一步地，所述菌株为真菌菌株或细菌菌株。本领域技术人员可根据所筛选的微 生物菌落形态区分真菌菌株和细菌菌株。
[0012] 进一步地，当所述菌株为真菌时，具体包括如下步骤：
[0013] 1)采集样品，制备样品悬液，并于含簇甲基纤维素钢平板培养基上培养，分离纯化 真菌菌株；
[0014] 2)将纯化后的真菌菌株含愈创木酪的PDA培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性 局的细菌菌株和真菌菌株；
[001引其中，所述含愈仓化酪的PDA培养基为含0.04% (w/w)愈仓化酪的PDA培养基。
[0016] 所述PDA培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物 试剂有限公司。
[0017] 3)将步骤2)筛选得到真菌菌株接种至PDA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入 低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的真菌菌株。
[001引所述PDA液体培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微 生物试剂有限公司。
[0019] 进一步地，所述步骤1)具体为:采集样品，制备样品悬液，并于含簇甲基纤维素钢 平板培养基上28Γ倒置培养72h，挑取不同形态的、生长良好的真菌单菌落反复划线，纯化 分离真菌菌株。在该培养条件下能够更好的利于真菌培养。
[0020] 所述含簇甲基纤维素钢平板培养基的配方为：CMC-Na 15g，（NH4)2S〇4 2g，MgS〇4 0.03邑，1(出口〇4 1邑，乳酸50邑，水比。
[0021] 进一步地，所述步骤2)中的筛选方法具体为:将纯化后的真菌菌株接入含愈创木 酪的PDA培养基中，根据菌落圈与变色圈的直径，计算变色系数(变色圈半径/菌落圈半径）， 筛选出产漆酶活性高的真菌菌株;即变色系数大于1.2的真菌菌株。
[0022] 所述步骤3)中的筛选方法具体为:堆腐7d后，取表面有明显微生物生长痕迹的低 阶煤，溶解于0.1 mo 1/L NaOH，过滤后烘干称滤渣重量，W未堆腐低阶煤为对照，根据低阶煤 固体损失量筛选出可降解低阶煤的菌株。
[0023] 举例说明，溶解腐殖酸的方法可为：取l-5g堆腐完成后混合均匀的低阶煤，加入 O.lmol/L NaOH 100-500ml，揽拌均匀后，使低阶煤中腐殖酸溶解。
[0024] 进一步地，当所述菌株为细菌时，具体包括如下步骤：
[0025] 1)采集样品，制备样品悬液，并于含簇甲基纤维素钢平板培养基上培养，分离纯化 细菌菌株；
[0026] 2)将纯化后的细菌菌株接入LB培养基中进行培养，筛选出产漆酶活性高的细菌菌 株；
[0027] 所述LB培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微生物 试剂有限公司。
[0028] 3)将步骤2)筛选得到的细菌菌株接种至NA液体培养基进行发酵培养，发酵后接入 低阶煤培养基堆腐，筛选降解效果较高的菌株。
[0029] 所述NA液体培养基为本领域常规配方，可自行配制或市售可得，如可购自杭州微 生物试剂有限公司。
[0030] 进一步地，所述步骤1)具体为:采集样品，制备样品悬液，并于含簇甲基纤维素钢 平板培养基上35Γ倒置培养4她，挑取不同形态的、生长良好的细菌单菌落反复划线，纯化 分离真菌菌株。
[0031] 所述含簇甲基纤维素钢平板培养基的配方为：CMC-Na 15g，（NH4)2S〇4 2g，MgS〇4 0.03g，Iffl2P〇4lg，7jaL。
[0032] 进一步地，所述步骤2)中的筛选方法具体为:将纯化后的细菌菌株接入到LB培养 基中，35°C恒溫培养4她，将漆酶检测液滴于菌落周围，筛选可使检测液变色的菌株，筛选出 产漆酶活性高的细菌菌株。
[0033] 所述漆酶检测液为0.25g愈创木酪溶于15ml 95%乙醇，或按此比例制备的漆酶 检测液。
[0034] 所述步骤3)中的筛选方法同真菌菌株步骤3)中的筛选方法。
[0035] 进一步地，前述低阶煤培养基的配方为:低阶煤10-100份，无机氮源1-10份，憐酸 二氨钟0.01-1份，水10-100份;所用低阶煤为泥炭、褐煤、风化煤中的一种或几种;所用无机 氮源为硫酸锭、憐酸一锭、氯化锭、硝酸锭、硝酸巧、硝酸钢、硝酸钟等中的一种或几种。
[0036] 进一步地，所述样品选自±壤样品、腐木样品、水样品、低阶煤等样品中的一种或 几种。
[0037] 作为优选，所述样品为腐木样品、低阶煤等样品中的一种或几种。
[0038] 本发明的有益效果在于：
[0039]