一种洛伐他汀酰基转移酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物合成领域，具体设及辛伐他汀的合成及合成用酶，更具体的，设及 较野生型酷基转移酶具有活性增强、产物耐受性提高的，非天然存在的酷基转移酶突变体、 编码所述酷基转移酶突变体的多核巧酸、包含此类多核巧酸的宿主细胞、所述酷基转移酶 的生产方法及使用本发明所述酷基转移酶突变体生物催化合成辛伐他汀的方法。
【背景技术】
[0002] 辛伐他汀（S imvastat in)是Merck公司研制的降血脂药，商品名Zocor，是洛伐他汀 的半合成衍生物，而洛伐他汀则由±曲霉(Aspergi 1 lus terreus)发酵液中分离得到。辛伐 他汀的药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内径甲戊二酷辅酶A还原酶化MG-CoA reductase)活性，限制HMG-CoA向甲基二径戊酸的转化，从而减少内源总胆固醇生物合成的 总量。与等剂量的洛伐他汀（lovastatin)相比，辛伐他汀可W更有效地降低血清中的总胆 固醇和低密度脂蛋白胆固醇。
[0003] 目前生产辛伐他汀使用的主流工艺路线由Sleiteinger提出，后经Verhoeven、 Kumar等修改提高。该路线W洛伐他汀为起始物，经历有机胺开环、双径基保护、甲基化、脱 保护、成锭盐、环合等工艺步骤，得到辛伐他汀：
但是，运一路线存在试剂毒性大，反应条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大等问 题，导致目前辛伐他汀的生产成本高、污染大。因此，急需一种毒性低、效率高、污染少的生 产方法。近年来，随着绿色化学概念的提出和对环境保护的日益重视，生物催化高效低毒低 污染的特点引起了人们的兴趣，并将注意力转向该领域。
[0004] W01994026920公布了一种利用脂酶和脂肪酶作为催化剂合成辛伐他汀的方法，由 于需要进行区域选择性醋化，仍必须对其它径基进行保护，导致产品收率降低。 W02005040107所公布的方法也存在同样的问题，效率仍未有明显提高。
[000引 US2009191602(A1)报道了 ±曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇，该基因簇编码一个 46邸a的蛋白质（SEQ ID No. 1)，即洛伐他汀酷基转移酶化ovD)，可将酷基硫醋的酷基基团 区域选择性酷基化莫纳可林J酸C8^基，为生物合成辛伐他汀的有效酶制剂：
虽然目前已经分离纯化并克隆表达出天然存在的LovD，但是野生型的LovD还存在很多 问题，如酶活性较低，产物抑制等，导致难W实现工业化应用。US20 10052038、 US2010050253、CN201310315499.0、CN201310345811.0 等对此进行研究，得到 了活性提高的 酷基转移酶突变体。然而不可忽视的是，上述突变体在高浓度条件下仍然存在产物/副产物 抑制现象，尽管采取一些措施，如使用沉淀剂使酶催化产物析出沉淀，添加活性炭等吸附剂 吸附反应副产物硫醇，缓解产物/副产物对酶的抑制，促使反应向产物方向移动，但是上述 方法仍不能彻底解决产物/副产物抑制问题，导致反应转化率通常在95%左右，降低了原料 利用率的同时，给下游分离纯化带来不便。因此，利用分子生物学手段对酷基转移酶进行改 造，在提高酶活性的同时，增强酶对产物/副产物的耐受性，解除产物抑制，是促进酷基转移 酶生产辛伐他汀产业化的有效途径。
【发明内容】
[0006] 本发明克服现有技术的不足，提供一种新的洛伐他汀酷基转移酶化ovD)突变体， 编码该突变体的基因，W及该突变体在制备辛伐他汀中的用途。
[0007] 本发明采用的技术方案是，一种洛伐他汀酷基转移酶突变体包括W下处理:在氨 基酸序列为SEQ ID NO. 1的野生型酷基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多 个氨基酸，或者/W及在氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的野生型酷基转移酶的氨基酸序列的一 个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸。与使用野生型酷基转移酶相比，其酷基转移 酶活性增强2-100倍。
[0008] 在本发明的一具体实施例中，所述突变体在氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的野生型 酷基转移酶的氨基酸序列的基础上，包括W下M1，V2，V11A，E28K，C111S，P125A，V159M， W174S，V19化，M24：3Q，K252R，T258S，肥63A，M33化，M36：3L，I373V，S393N，K307H中的任意1至 18个氨基酸突变；W上各突变用Ξ联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨 基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨 基酸的氨基酸。所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
[0009] 本发明还提供一种编码W上洛伐他汀酷基转移酶突变体的编码基因的其DM序列 为SEQ ID NO.5。其已经过密码子优化W适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核 巧酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物 的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在运些微生物的表达特定的氨基酸的优 化的密码子。
[0010] 本发明的又一具体实施例中提供一种包含编码洛伐他汀酷基转移酶突变体的编 码基因的重组质粒。利用该重组质粒和大肠杆菌作为宿主细胞，构建一种重组菌。其中大肠 杆菌选用大肠杆菌E.coli D册α。
[0011] 本发明的实施例中还提供一种洛伐他汀酷基转移酶突变体用于催化莫纳可林J和 曰-二甲基下酷基-S-丙酸甲醋反应合成辛伐他汀的用途。
[0012] 源于±曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酷基转移酶的酷基转移酶突变体， 能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J(Monacolin J)转化为辛伐他汀。所述酷 基转移酶突变体，与SEQ ID NO. 1的野生型酷基转移酶相比表现出更强的催化活性。酷基转 移酶突变体和编码运种突变体的多核巧酸可W使用本领域技术人员通常使用的方法制备。 突变体可W通过使编码该酶的体外重组、多核巧酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化 方法等获得。
[001引本发明的LovD突变体在活性提高的同时，对产物/副产物的耐受性较野生型有明 显的改善，提高了原料利用率，降低了成本，减少了能耗和环境污染。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1野生型及酷基转移酶突变体表达载体的构建 将来自±曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酷基转移酶（氨基酸序列为SEQ ID NO. 1)，将野生型酷基转移酶的核酸序列进行优化（即获得SEQ ID NO. 2)(见化igb0 P， Guzman E, Romeu A, Garcia-Vallv有 S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DM sequences. Nucleic Acids Res. 2007)。通过基于PCR的全基 因合成