一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其设及一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，植物每年通过光合作用，能产 生高达15.5Xl〇w吨纤维素类物质，其中纤维素、半纤维素的总量为8.5Xl〇w吨。纤维素是 植物(包括某些真菌和细菌）的结构多糖，是它们细胞壁的主要成分。木材的大于50%，麻纤 维的70-80%，棉纤维的90-98%。木质纤维素是由D-葡萄糖借β-(1，4)糖巧键连接的直链多 糖，纤维素多糖可W被酶水解糖化降解成为葡萄糖，最终经生物转化生成乙醇，经过蒸馈就 可W得到洁净的乙醇作为能源，代替不可再生的石油资源。
[0003] 纤维素酶系是一组协同作用降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据各种酶的作 用不同主要分为Ξ类： (1) β-葡聚糖内切酶(EC 3.2.1.4，endo-1,4-0-D-glucanase，Ε(}):可结合在纤维素链 内部的非结晶区的任何部位随机水解0-1，4糖巧键，切断纤维素链产生有非还原端的小分 子纤维素，主要产物是纤维二糖、纤维Ξ糖和纤维寡聚糖等。
[0004] (2)葡聚糖外切酶(EC 3.2.1.91，ex〇-l，4-i3-D-glucanase，CBH):葡聚糖外切酶是 纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程主导作用，从纤维素链的末端水解0- 1，4糖巧键，依次切下纤维二糖分子，生成葡萄糖、纤维寡聚糖和纤维二糖。葡聚糖外切酶可 W从线状分子的纤维素水解切下纤维二糖单位，故又称为纤维二糖水解酶 (cellobiohydrolase)。
[0005] (3) β-葡萄糖巧酶(EC 3.2.1.21，i3-l，4-glucosidase，BG):i3-葡萄糖巧酶将纤维 二糖或其他可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子，也称纤维二糖酶。纤维寡聚糖和纤维二 糖对内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶具有强烈的抑制作用，β-葡萄糖巧酶可W消除纤维二糖 对内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶的反馈抑制作用，提高纤维素酶的降解效率，在纤维素的 降解中起着非常关键的作用。
[0006] 在运Ξ类酶的协同作用下，纤维素最终被降解为葡萄糖。在植物纤维素中，结晶状 的纤维素微纤丝紧紧的被木质素和半纤维素包裹着，木聚糖酶可W降低纤维素生物质颗粒 的大小和机械晶格，破坏賴杆中的纤维素、半纤维素与木质素的结构，使之松散。自然界中 有产纤维素酶的微生物主要是霉菌和细菌，目前用于生产纤维素酶的菌种主要有木霉属 (Trichoderma)、青霉(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)的菌种。应用最广的纤维素 酶生产菌是木霉属(Trichoderma)菌种，但木霉属菌种常常存在β-葡萄糖巧酶活力较低的 不足，导致纤维二糖积累，降低酶解效率。由于目前的纤维素酶普遍存在着酶活力低、成本 高的缺陷，用木质纤维素生产燃料乙醇至今不能真正实现工业化，开发新的纤维素酶资源 一直是研究热点。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题，提供一种米曲霉发酵酶液的提取 物及其应用，所得提取物同时具有葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶活性，耐高溫，宽抑耐受范 围，在纤维素水解糖化应用上具有良好的应用潜能。
[0008] 本发明采用的技术方案如下： 一种米曲霉发酵酶液的提取物，所述提取物是由米曲霉HML366通过下述步骤制备得 到： (1) 将米曲霉歷L366的PDA斜面菌种制成抱子液，取抱子液中抱子于纤维素酶复筛固 体培养基中，30°C恒溫培养5-8天； (2) 在步骤（1)所得培养物中加入150-250mL无菌重蒸水，40°C恒溫水浴1-2小时，然后 浸提、过滤并离屯、得到粗酶液； (3) 收集步骤(2)所得粗酶液中的上清酶液，使用纤维素超滤柱将所述上清酶液浓缩， 再使用阴离子交换层析纯化，得到成品。
[0009 ] 进一步地，所取抱子液中抱子的个数为105-108个。
[0010] 进一步地，步骤（1)所述纤维素酶复筛固体培养基为：12 g薦渣，8 g教皮，60 mL Mandels营养盐液。
[0011] 进一步地，步骤(2)所述离屯、的转速为4500-5500r/min，时间为10-30min。
[0012] 进一步地，步骤(3)中，使用纤维素超滤柱将上清酶液浓缩，浓缩至原来上清酶液 1/5体积。
[0013] 进一步地，所述纤维素超滤柱为3000化纤维素超滤柱。
[0014]进一步地，步骤（3)中，使用阴离子交换层析，压力为580 psi，WpH 8.3的0.01 mol/L Tris-HCl为起始缓冲液，在所述起始缓冲液中添加1 mol/L的化C1为洗脱缓冲液， 纯化至NaCl摩尔浓度为0.27 mol/L时，得到成品。
[0015] 进一步地，步骤(3 )所述浓缩、纯化均在2~4 °C进行。
[0016] 本发明还提供如上所述一种含有米曲霉发酵酶液提取物的组合物。
[0017] 如上所述的米曲霉发酵酶液提取物及其组合物在降解植物纤维素中的应用。
[0018] 本发明所用的米曲霉丽L366已经在非专利文献中公开，文献出处为：Yongling Qin, Yunkai Zhang, Haiyan HE, et al. Screening and Identification of a Fungal β-Glucosidase and the Enzymatic Synthesis of Gentiooligosaccharide. Applied Biochemishy and Biotechnology,2011,163:1012-1019;申请人已保证从申请日起二十 年内向公众发放该生物材料。
[0019] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是： (1)本发明由米曲霉HML366发酵酶液得到的提取物，同时具有葡聚糖外切酶和葡聚糖 内切酶活性，酶活性高，耐高溫，宽抑耐受范围，可W显著提高纤维素酶系的降解能力，改善 纤维素酶系的协同作用。
[0020] (2)本发明的米曲霉发酵酶液提取物的制备方法简单，在得到粗酶液后只需经过 纤维素超滤柱浓缩和阴离子交换层析纯化，即可得到成品。3000化纤维素超滤柱可W有效 的脱除粗酶液的盐分和小分子量杂质，在抑为8.3的缓冲液条件下，阴离子交换层析对酶蛋 白的吸附洗脱分离效果好。
【附图说明】
[0021 ]本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中： 图1是阴离子交换层析蛋白纯化图； 图2是本发明的米曲霉发酵酶液提取物的SDS-PA(iE电泳图； 图3是米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖外切酶酶活快速检测效果图； 图4是米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖内切酶酶活快速检测效果图； 图5是米曲霉发酵酶液提取物的酶最适溫度和溫度稳定性图； 图6是米曲霉发酵酶液提取物的酶最适pH和pH稳定性图； 图7为HML CBH1经膜蛋白酶消化后的飞行时间质谱分析图； 图8为飞行时间质谱结果图； 图9为米曲霉发酵酶液提取物的保守序列分析图； 图10为米曲霉发酵酶液提取物的序列功能分析图。
【具体实施方式】
[0022] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤W外，均可任何方式组合。
[0023] 本说明书(包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可 被其他等效或具有类似目的的替代特征加 W替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列 等效或类似特征中的一个例子而已。
[0024] 米曲霉发酵酶液提取物的制备 本实施例使用的培养基包括如下几种： (1)马铃馨葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基）：马铃馨200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0~ 20.0 g，蒸馈水1000 mL，抑自然。
[00巧](2)纤维素酶复筛固体培养基：12 g薦渣，8 g教皮，60 mL Mandels营养盐液。
[0026] (3)Mandels 营养盐液：（NH4)2S04 1.4 g，K此P〇4 2 g，CaCl2 0.3 g，MgS〇4 · 7出0 3 g，FeS〇4· 7出0 5 mg，MnS〇4 1.6 mg，CoCb 2.0 mg，aiCl2 1.7 mg，定溶于 1000 mL蒸馈 水中。
[0027] 本发明的一种米曲霉发酵酶液的提取物，所述提取物是由米曲霉歷L366通过下述 步骤制备得到： (1) 将米曲霉丽L366的PDA斜面菌种用10 mL生理盐水洗下制成抱子液，采用血球计数 板在显微镜下直接测定抱子数，取1〇7个抱子于纤维素酶复筛固体培养基中，置于500 mL 锥形烧瓶内混匀，每天翻动两次，30°C恒溫培养5-8天； (2) 在步骤(1)所得培养物中加入200mL无菌重蒸水，40°C恒溫水浴1-2小时，然后浸提、 四层纱布过滤并5000 r/min离屯、20 min,得到粗酶液； (3) 收集步骤(2)所得粗酶液中的上清酶液，4°C保存;使用纤维素超滤柱将所述上清酶 液浓缩至原来上清酶液5分之一体积，再使用阴离子交换层析分离纯化，用10 mL起始缓冲 液把样品带入阴离子交换层析柱，设计100 mL洗脱缓冲液，流速ImL/min，洗脱缓冲液浓度 线性递增50%洗脱分离酶蛋白，每管收集1 ιΛ;大约在64 min在0.27 mol/L化C1浓度时 洗出的提取物收集在第31管，即得成品。
[002引其中，阴离子交换层析中压力为580 口31，^抑8.3的0.0111101/1化13-肥1为起 始缓冲液，在所述起始缓冲液中添加1 mol/L的NaCl为洗脱缓冲液。
[0029] 参见附图1为阴离子交换层析蛋白纯化图。其中，A为蛋白质紫外吸收曲线，B为电 导率曲线;横坐标为洗脱时间，左边纵坐标为280nm蛋白质紫外吸收值(AU)及洗脱缓冲液浓 度（％)，右边纵坐标为电导值(Conductivity，mS/cm)。
[0030] 表1为米