一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，具体设及一种尖吻峻蛇凝血酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 蛇毒是毒蛇毒腺分泌的一种成分复杂的液体，含有多种蛋白质、多肤、酶类和其它 小分子物质，具有广泛的生物活性，目前研究人员已从幢科桐峻蛇属峻蛇 (Bot虹opsatrox)、长白山白眉峻蛇等蛇毒中发现多种类凝血酶。
[0003] 尖吻峻蛇(Agkis化odonacutus)，幢科尖吻峻属，广泛分布于中国华南地区。尖吻 峻蛇凝血酶化aemocoagulaseAcu化S，简写为化lase)是从尖吻峻蛇蛇毒中分离纯化的一种 类凝血酶。它通过水解纤维蛋白的Αα链，使纤维蛋白原降解为纤维蛋白单体。专利 CN1218747公开了尖吻峻蛇凝血酶化lase用作治疗出血性疾病药物的用途，药理和毒理研 究表明其具有较强的止血作用和极低的毒性。
[0004] 专利CN100523185公开了一种尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，通过透析、两步 DEAE-SepharoseFF层析梯度洗脱和SephadexG25层析分离得到蛇毒类凝血酶，其纯度为 95%。
[0005] 专利CN101812436公开了一种单肤链的尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法，得 率为0.028%。其工艺包含^次0646-5日9}1日'〇3日。。层析，其中前两次使用酸性的低浓度 NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，第Ξ次层析使用碱性的低浓度NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱。
[0006] 专利CN101 5605 10公开了 一种尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶，通过在两次DEAE- SepharoseFF中使用碱性化C1-PBS溶液进行梯度洗脱，再采用透析或Se地adex-G25脱盐制 备得纯度不低于95%的产品，得率为0.7%-0.8%。
[0007] 专利CN102757948公开了一种低流速下通过两次Se地adex-G75层析和一次DEAE- S巧haroseFF层析制备出纯度为97.5%的尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶的方法。
[000引专利CN103160485公开了 一种尖吻峻蛇凝血酶-C，通过硫酸锭分级沉淀、两次 DEAE-SepharoseFF层析，最后W透析或S邱]iadex-G25脱盐得到比活力不低于40U/mg、纯度 不低于95 %的尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶。
[0009] 现有的从尖吻峻蛇蛇毒中提取纯化尖吻峻蛇蛇毒类凝血酶的方法大多设及长时 间的透析且需多次换液，另外阴离子交换层析步骤往往要求线性洗脱或多步洗脱，存在方 法复杂、效率不高等问题。
[0010] 因此，有必要寻找一种简单高效、可应用于大规模生产的分离纯化工艺，制备出高 活性的尖吻峻蛇凝血酶。
【发明内容】
[0011] 本发明目的在于提供一种尖吻峻蛇凝血酶及其制备方法。该方法适合大规模生 产、操作简单、效率高;制备的尖吻峻蛇凝血酶产品产率高，纯度高达99% W上，比活力不低 于180U/mg。
[0012] 本发明提供的技术方法通过W下步骤实现：
[0013] (1)粗品澄清：W0.01M憐酸盐缓冲液溶液(pH值为6.2~6.9)溶解尖吻峻蛇蛇毒粗 品制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45WI1的微滤膜过滤，收集滤液；
[0014] (2)超滤除杂:将步骤(1)所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液；
[001引 （3)将步骤（2)所得滤液进行DEAE-SepharoseFast Flow第一次层析，用含 0.05M化C1的0.01M憐酸盐缓冲液（pH值为6.2~6.9)洗脱，收集有效峰组分，W孔径为 10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
[0016] (4)将步骤（3)所得滤液进行DEAE-Sepharose化St Flow第二次层析，用含0.03M 化C1和0.1M化C1的0.01M憐酸盐缓冲液(pH值为7.2~7.9)-憐酸盐缓冲液依次洗脱，收集 有效峰组分，W孔径10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液；
[0017] (5)除热原：将步骤(4)所得滤液使用Superdex-75pg层析柱，用0.01M憐酸盐缓冲 液溶液(pH值为7.2~7.9)洗脱，收集有效峰组分；
[0018] (6)脱盐:将步骤(5)所得滤液使用Sepadex-G25层析柱，用注射用水洗脱，对已除 热原的上述组分进行脱盐，收集有效峰组分，得到尖吻峻蛇凝血酶。
[0019] 将所得的尖吻峻蛇凝血酶加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，可制作成注射用尖吻 峻蛇凝血酶。
[0020] 步骤(1)是对尖吻峻蛇蛇毒的预处理，W微滤替代传统的离屯、取上清液，可有效去 除悬浮物、部分细菌、大分子胶体等物质，获得适合进一步分离的澄清蛇毒溶液，操作简便、 效率高。
[0021] 步骤(2)通过超滤截留分子量大于lOkDa的物质，可除去蛇毒溶液中大部分小分子 杂质。应用超滤技术，操作简单，截留效果好，能够极大地提高下一步阴离子交换层析的分 离效率。而传统的透析方法不仅耗时长，且若透析期间换液不当会严重影响透析效果。
[0022] 步骤(3)使用偏酸性的憐酸盐缓冲液冲洗，再用含低浓度化C1的憐酸盐缓冲液进 行目标物的洗脱。
[0023] 步骤(4)使用偏碱性的憐酸盐缓冲液冲洗，再分别两个不同浓度的化α-憐酸盐缓 冲液进行目标物的洗脱。步骤(4)可分离得尖吻峻蛇凝血酶，纯度可达到95% W上。操作简 单，纯化效率高。
[0024] 步骤(5)中的Superdex-75pg层析柱分辨率高，可进一步纯化尖吻峻蛇凝血酶并去 除热原。步骤(6)采用S邱adex-G25层析柱进行脱盐。由于脱盐后的蛋白质容易变性，在对尖 吻峻蛇凝血酶去除热原后再进行脱盐可最大限度地保留酶活力。脱盐后的尖吻峻蛇凝血酶 宜马上冷冻干燥，或加入赋形剂制成冻干粉注射剂等剂型。
[0025] 本发明分离纯化的尖吻峻蛇凝血酶的HPLC分析纯度高达99^上％，比活力不低于 180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
[0026] 本发明的优势在于，通过微滤与超滤可替代长耗时且操作相对复杂的离屯、与透 析，在有效缩短分离纯化工艺时间，同时较好地保护了尖吻峻蛇凝血酶的活性。两步阴离子 柱层析的洗脱步骤简单明确，可控性强;结合超滤技术，大大提高了尖吻峻蛇凝血酶分离纯 化的效率，得率远高于现有技术，适合大规模工业化生产。
【附图说明】
[0027] 图巧本发明实施例1制得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC图谱。
[0028] 图2为本发明实施例1制得的尖吻峻蛇凝血酶的SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不局限于此。 根据本发明精神对本发明方法、步骤或条件所作的修改均属于本发明的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 取尖吻峻蛇蛇毒粉末7.5g，至于4°C层析柜中用0.01M憐酸盐缓冲液溶液(pH 6.8) 揽拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用憐酸盐缓冲液稀释，使用如ixStandand Benchtop System (GE Healthcare公司）进行微滤（微滤柱型号：CFP-4-E-4MA，0.45皿，GE Healthcare)，收集 滤液并加入憐酸盐缓冲液稀释。使用QuixStandand Benchtop System对上述滤液稀释液进 行超滤（超滤柱型号：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare),样品溶液用于进一步的层 析。层析柱皆连接于AKTA prime plus蛋白分离纯化仪(GE Healthcare)。
[0032] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH6.8)先平衡DEAE-SepharoseFastFlow层析柱 (GE化althcare)，然后对上述样品溶液进行上样（lOml/min)。上样完毕后，即用0.01M憐酸 盐缓冲液溶液(pH 6.8)冲洗(35ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含0.05MNaCl的 0.01M憐酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱目标物（1〇1111/111山），收集出峰组分，超滤浓缩。用册1(：、 SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分，结果与目标产一致。
[0033] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液(pH7.5)先平衡DEAE-Sepharose化stFlow层析柱(GE 化althcare)，然后对上述滤液进行上样（lOml/min)。上样完毕后，即用0.01M憐酸盐缓冲液 溶液(pH 7.5)冲洗(35ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03M化α和0.1M 化C1的0.01Μ憐酸盐缓冲液(pH 7.5)洗脱目标物(2〇1111/111^)，收集出峰组分，并超滤浓缩， 收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
[0034] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH 7.5)先平衡S叫erdeχ-75pg层析柱（GE 化althcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样(20ml/min)。上样完毕后，用0.01M 憐酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)洗脱目标物(20ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、SDS-PAGE 电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
[0(X3日]用注射用水先平衡Se地adex-G25层析柱(GE化althcare)，然后对上述溶液进行 上样(20ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(20ml/min)，收集出峰组分。经测定， 分离纯化所得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC分析纯度高达99.69 %，得率为:8.43 %。结果见表1、 表2。尖吻峻蛇凝血酶比活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
[0036] 表1尖吻峻蛇凝血酶的HPLC谱图相对峰面积
[0037]
[0038] 表2尖吻峻蛇凝血酶的分离纯化结果
[0039]
[0041 ] 实施例2
[0042] 取尖吻峻蛇蛇毒粉末30g，至于4°C层析柜中用0.0 IM憐酸盐缓冲液溶液(pH 6.5) 揽拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用憐酸盐缓冲液稀释，使用如ixStandand Benchtop System (GE Healthcare公司）进行微滤（微滤柱型号：CFP-4-E-4MA，0.45皿，GE Healthcare)，收集 滤液并加入憐酸盐缓冲液稀释。使用QuixStandand Benchtop System对上述滤液稀释液进 行超滤（超滤柱型号：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare),样品溶液用于进一步的层 析。层析柱皆连接于AKTA prime plus蛋白分离纯化仪(GE Healthcare)。
[0043] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH6.2)先平衡DEAE-SepharoseFastFlow层析柱 (GE化althcare)，然后对上述样品溶液进行上样