一种小麦胚特异表达启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种小麦胚特异表达启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于结构基因5'端转录起始位点（transcription s1:a;rt site,TSS)上 游的一段可与RNA聚合酶II和转录因子结合形成一个转录起始复合体从而启动其下游结构 基因转录起始的DNA区段。它决定着转录的方向和效率，是结构基因表达在转录水平的调控 中屯、。
[0003] 通常根据启动子的作用方式和功能，可将植物基因启动子分为组成型启动子、组 织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子的基因表达不具组织和时间特异性，表达 水平相对稳定，外界因素对组成型启动子启动的外源基因的表达也几乎没有影响。常用的 组成型启动子有来自烟草花叶病毒基因启动子化MV35S，水稻肌动蛋白基因（actinl)启动 子和玉米泛素蛋白基因（ubiquitin-1)启动子。诱导型启动子驱动的下游结构基因则在外 部环境信号、植物内部生长代谢信号的诱导下才表达。植物对不利于其生长发育的外界环 境信号如寒、旱、碱和病虫害等，都会诱导一些基因的表达来抵御运些逆境。诱导型启动子 中具有与诱导表达相关的各种元件，包括应答光信号、代谢调控信号、生物胁迫信号、环境 信号的元件等。组织特异性启动子驱动下游结构基因在植物不同发育阶段特定的组织中表 达。组织特异性启动子不仅能够在一定器官或组织部位积累目的基因的表达产物，增加区 域表达量，同时也能避免植物营养的不必要浪费。
[0004] 启动子在植物生物学和生物技术研究中有着至关重要的作用，它的应用大体可W 分为Ξ类:1、驱动外源基因在植物体中的表达，从而获得有利于农业生产的有利性状，或者 用于转基因研究；2、W植物体为生物反应器，驱动外源基因在植物体整株表达或某组织器 官特异表达生产外源蛋白；3、利用植物代谢中的关键基因在同源或异源植物系统中表达， 从而修饰或调解植物生理状况。在植物转基因技术中常需要筛选标记基因来赋予被转化细 胞抗性，然后在一定筛选压下筛选出阳性细胞，再进一步分化出转基因植株，而运类筛选标 记基因则需要如化MV35S的组成型启动子驱动，从而在转基因植株生长发育的各个阶段各 个组织中均表达，有利于转基因植物的筛选。另外，在农业生产应用中，还可W通过相关启 动子来驱动各种抗性基因，从而使农作物获得抗旱、抗病、抗虫和抗除草剂等性状，W提高 其产量。植物启动子也可W应用于过表达一些代谢途径关键节点的酶基因或者一些微量元 素转运的转运子来修饰代谢途径，实现提高植物产品的质量和产量。
[0005] 启动子除了应用于修饰植物的性状外，其更重要的应用是W植物为生物反应器生 产各种外源蛋白。例如，利用组成型启动子CaMV35S和泛素蛋白基因启动子已经成功在植物 体中表达生产了抗原蛋白基因霍乱毒素 B亚基、不耐热肠毒素 B亚基、乙肝表面抗原、保护性 抗原、狂犬病病毒糖蛋白G和SARS病毒糖蛋白S。利用组织特异性启动子也广泛应用于外源 蛋白的表达生产，如马铃馨块茎特异启动子被应用于生产霍乱毒素 B亚基、不耐热肠毒素 B 亚基和乙肝表面抗原。另外，基于种子生物反应器的优势，许多外源蛋白W种子为反应器进 行生产，如利用水稻胚乳特异性启动子Gtl3a在水稻胚乳中规模化生产了具有生物活性的 人血清白蛋白，在玉米胚乳特异性启动子LeglA的驱动下大规模的生产了饲料用酶植酸酶， 在大麦醇溶蛋白基因启动子驱动下在小麦种子中生产热稳定性良好的植酸酶。
[0006] 鉴于启动子在植物生物学和生物技术研究中的成功应用，对新的启动子特别是组 织特异性启动子的克隆具有重要意义。小麦作为世界上重要的粮食作物之一，对小麦组织 特异启动子，特别是小麦种子特异启动子，进行克隆与研究尤为重要。目前报道的小麦种子 特异启动子除胆藏蛋白相关基因启动子外，鲜有其他种子特异启动子报道，并且运些启动 子主要在小麦种子胚乳中有活性。所W，对小麦展开种子组织特异性启动子，特别是种子胚 启动子的克隆尤为迫切且十分重要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种小麦胚特异表达启动子及其应用。
[0008] 本发明提供的启动子，命名为P-WZ，获自于小麦品种中国春，为如下1)或2)或3):
[0009] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0010] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0011] 3)与1)限定的DNA序列具有90 % W上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
[001^ 上述严格条件可为在0.1 XSS阳(或0.1 XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C条件下杂 交并洗膜。
[0013] 含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保 护范围。
[0014] 所述重组载体可为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入所述启动子得 到重组质粒。所述植物表达载体具体可为载体地GWSF7.0。所述重组载体具体可为将所述启 动子插入植物表达载体PBGWSF7.0的重组位点间得到的重组质粒。所述重组载体具体可为 将所述启动子取代植物表达载体pBGWS巧.0的attRl位点和attRl位点之间的小片段，得到 的重组质粒。
[0015] 扩增所述启动子的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引 物对具体可由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组 成。
[0016] 本发明还保护所述启动子在启动目的基因表达中的应用。所述启动目的基因表达 可为启动目的基因特异性表达。所述特异性表达具体可为种子胚特异性表达。所述启动目 的基因表达具体可为启动植物中的目的基因表达。所述植物可为单子叶植物或双子叶植 物。所述单子叶植物可为被子植物。所述被子植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾 本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦科农 199。所述目的基因具体可为GUS基因。
[0017] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用所述启动子启动目 的基因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。所述"表达所述目的基因"可为"在种 子胚中特异性表达所述目的基因"。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子 叶植物可为被子植物。所述被子植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所 述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦科农199。所述目 的基因具体可为GUS基因。所述方法中，可将特异DM分子导入所述出发植物，从而在所述出 发植物中用所述启动子启动目的基因的表达;所述特异DNA分子自上游至下游依次包括所 述启动子和所述目的基因。所述特异DNA分子具体可通过含有所述特异DNA分子的重组表达 载体导入所述出发植物。所述重组表达载体具体可为W上任一所述的重组载体。
[0018] 本发明还保护一种制备目的蛋白的方法，是在出发植物中用所述启动子启动所述 目的蛋白的编码基因的表达，得到所述目的蛋白。所述目的蛋白特异性存在于植物种子胚 中。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为被子植物。所述被子 植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦属植物。 所述小麦属植物具体可为小麦，例如小麦科农199。所述目的蛋白具体可为GUS。所述目的蛋 白的编码基因具体可为GUS基因。所述方法中，可将特异DNA分子导入所述出发植物，从而在 所述出发植物中用所述启动子启动所述目的蛋白的编码基因的表达;所述特异DNA分子自 上游至下游依次包括所述启动子和所述目的基因。所述特异DNA分子具体可通过含有所述 特异DNA分子的重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载体可为W上任一所述的 重组载体。
[0019] 本研究发明的发明人发现了一个在小麦种子胚中特异表达的启动子，并通过转基 因实验证明了该启动子在小麦种子胚中特异、高效表达。本发明可应用于植物(例如小麦） 种子性状的遗传改良或植物(例如小麦)生物反应器等，具有巨大的科研及商业应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1为载体pD0NR?221的结构示意图。
[0021] 图2为载体地GWSF7.0的结构示意图。
[0022] 图3为PCR扩增产物的电泳图。
[0023] 图4为部分T1代植株的PCR鉴定结果。
[0024] 图5为GUS组织化学染色的结果;A:小麦科农199的成熟种子;B:授粉后15天的纯合 的转基因株系的T2代植株上长的种子;C:授粉后25天的纯合的转基因株系的T2代植株上长 的种子;D:未进行任何处理的纯合的转基因株系的T2代植株上长的成熟种子;E:吸水12小 时后的纯合的转基因株系的T2代植株上长的成熟种子;F:吸水36小时后的纯合的转基因株 系的T2代植株上长的成熟种子;G:纯合的转基因株系的T3代植株Ξ叶期的叶片;H:纯合的 转基因株系的T3代植株Ξ叶期的根;I:纯合的转基因株系的T3代植株Ξ叶期的幼茎。
【具体实施方式】
[0025] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0026] 载体pD0NR?221 (结构示意图见图 1): Invitrogen，12536-017。
[0027] 载体 pBGWSF7.0(结构示意图见图2):参考文献：Karimi，M.，Inz 自，D.，Depicker， A.,Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci.2002May;7(5):193-195。
[0028] 小麦"中国春"（简称小麦中国春）：参考文献:彭远英，彭正松，宋会兴.小麦中国春 背景下长穗偃麦草光合作用相关基因的染色体定位[J].中国农业科学，2005,38(11): 2182-2188。
[0029] 小麦"科农19沪（简称小麦科农199):参考文献:张讳，王静，纪军，王志国，安调过， 张相岐，张爱民，李俊明.冬小麦新品种"科农199"选育和推广[J].中国生态农业学报.2011 (05)。
[0030] 实施例1、启动子的发现
[0031] 提取小麦品种中国春的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析 与功能验证，从cDNA中发现了 一个种子特异表达的miRNA，将其命名为miRNA-wz。基