一种烟草基因NtTCTP及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种烟草基因化TCTP及其用途，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 翻译控制肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor proteinJCTP)， 也称p21或p23,是真核生物中遍在表达和分布的一种蛋白。其最早发现于哺乳动物肿瘤 细胞中，并在转录后水平受到调控。
[0003] 多种生物中的大量研究发现TCTP参与多种细胞学过程，如促进组胺释放，细胞 调亡，微管组装、离子平衡等，并与一系列蛋白，如polo激酶、tubulin、actin和钢钟ATP 酶等有相互作用。动物中TCTP参与细胞生长分化，恶性转化，抗逆W及细胞调亡等。敲除 TCTP基因后的老鼠，由于缺少细胞分化和过度细胞调亡，导致老鼠出现胚胎致死现象。果蛹 中，某一特异器官中TCTP表达被中断后，该器官细胞数目下降和细胞生长出现缺陷最终导 致该器官变小。植物中TCTP mRNA表达与有丝分裂密切相关，黑暗可W诱导牵牛中TCTP mRNA积累。另外，TCTP蛋白在调节初皮部蛋白的长距离运输和花粉管生长的过程中发挥 着重要作用。最近研究发现，拟南芥中，TCTP作为有丝分裂生长的正调控因子，能够特异调 控细胞周期的时间。TCTP通过TOR(化rget of rapamycin)生长调控途径调节细胞分化。 卷屯、菜中的研究发现，TCTP不仅调控生长发育，同时受外界环境诱导。运些已有研究表明， TCTP不仅能够调控有机体生长发育，而且具有植物专属功能，因此，研究该类基因对PVY的 抗性研究，具有重要意义。
[0004] 挖掘植物基因组中抗马铃馨Y病毒(potato virus Y，PVY)，是植物抗病毒育种的 关键。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是：提供一种烟草基因化TCTPW及该基因编码的蛋白 质，该基因的活性与烟草抗PVY的抗性密切相关。
[0006] 本发明的技术方案是：一种烟草基因化TCTP，具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序 列。
[0007] 一种烟草基因化TCTP编码的蛋白质，具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[000引一种烟草基因化TCTP用于调节烟草对PVY的抗性。
[0009] 本发明的有益效果:本发明提供一个烟草翻译控制肿瘤蛋白基因，命名为化TCTP， 该基因全长507bp，编码一个含168个氨基酸的蛋白，并研究了该基因在烟草抗PVY过程中的 作用。在栽培烟草中沉默该基因，烟草表现出对PVY更强的抗性，可达到免疫水平，在栽培烟 草中超量表达该基因，烟草对PVY更敏感。说明该基因在烟草抗PVY过程中具有重要作用，可 用于烟草等植物抗PVY育种。
[0010] 首先克隆得到烟草中翻译控制肿瘤蛋白基因化TCTP，并构建该基因的RNAi表达载 体，通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化，结果表明，该基因在烟草中沉默后，提高烟草对 PVY的抗性，抗性可提高50%-80%。
【附图说明】
[0011]图1为不同株系中TCTP基因的western杂交验证； 图2为TCTP超量表达株系02、07;TCTP沉默株系化16、Ri20和野生烟草WT的叶片性状图。
【具体实施方式】 [001引一、材料与方法 1.实验材料 1.1栽培烟草品种"山西烟"，本研究室保存，Escherichia coli DH5a、根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)、植物表达载体地in438均为实验室保存。
[001引 1.2试剂LA Taq酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司。DNA凝胶纯化回收试剂盒购自 天根生化科技（北京）有限公司。T4 DNA连接酶购自肥B公司；pGEM-T vector载体购自 Promega生物技术有限公司。ABI PRISMTM Optical 96-Well Reaction Plates, Optical 化ps购自ABI公司；DNA合成及测序由华大基因科技服务有限公司完成。
[0014] 2.实验方法 2.1引物设计 根据登录到Genbank数据库中的糖基转移酶4的全长序列设计扩增全长基因的引物，并 添加酶切位点Sal I和BamH I ' 2.2基因全长扩增I
' 在0.2ml离屯、管中加入下列试剂：
PCR反应程序为:加热盖，95° C预变性5min;然后95° C变性30s，55° C退火30s，72° C延伸 2min，35个循环；最后72°C再延伸lOmin。
[001引 2.3全长表达载体构建 糖基转移酶4 pBin438植物表达载体，载体及全长扩增PCR产物分别用Sal I和BamH I 双酶切，酶切体系如下：
酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR酶切产物和载体地1121/ pBin438的大 片段，连接。回收产物按下列比例进行定向连接。连接体系如下:_^
16Γ连接16小时或更长，W增加连接效率。
[0016] 2.4重组质粒转化根癌农杆菌 1) 取0.5~1.0化的DNA，加入到根癌农杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴5min，迅速投 入液氮中冷冻5min; 2) 37°C水浴融化，加入800化Y邸液体培养基，28°C，100 r/min，振荡培养4h; 3) 4 000 r/min，离屯、5min，倒去大部分上清液，余100化左右，悬浮菌体； 4) 涂布在含有40 mg/L Rif、50 mg/L Sm和100 mg/L Km的固体Y邸培养基上，28°C培养 48~96h。
[0017] 2.5根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化先将烟草叶盘预培养2-3天，然后用含有 植物表达载体的根癌农杆菌EHA105分别进行侵染。共培养3-4天后，将叶盘取出，在含有除 菌剂的液体培养基中除菌2-化，然后再转到筛选培养基进行筛选及分化培养，约3周左右开 始分化出抗性芽。待抗性芽长至3-4cm高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基上 进行生根培养。待小植株根系发达后，进行驯化移栽。得到大量移栽成活的抗性植株。将PCR 检测呈阳性的植株移栽到大花盆中，直到收获种子。
[0018] 2.6根癌农杆菌介导的大豆的遗传转化大豆品种黑农63种子经水漂洗后，用70% 酒精消毒lmin，0.1%的升隶消毒7min，无菌水冲洗3~5次，充分浸种至膨胀，接种在发芽培养 基上，26±rC，光照16h/d。取无菌苗剥去种皮，用手术刀将下胚轴截断，保留3mm下胚轴，然 后沿两片子叶的纵轴从下胚轴的中间切开，分别切去顶芽及侧芽，在子叶节部位轻微刮伤 并沿子叶纵轴划几刀，将子叶节近轴面朝上插入PM培养基中培养Id;将子叶放入菌液中，侵 染30min，期间不断轻轻摇动;倒掉菌液，将外植体W近轴面朝下接种在共培养培养基中，暗 处共培养4d;除菌：用含有500mg/L头抱嚷目亏钢的无菌水冲洗Ξ遍，然后转移至筛选培养基 上培养;侵染14 d后统计大豆子叶节丛生芽分化率。
[0019] 2.6 PVY接种，抗病调查。
[0020] PVY接种物制备:将新鲜的病叶加入在打碎机中，加少量憐酸缓冲液打碎，用纱布 过滤去病叶残体，取新鲜的汁液制成P VY接种物。 PVY接种:接种时期为烟草4叶期，在欲接种的烟株上选择2~3片幼嫩叶片用砂纸轻 轻摩擦，产生微伤，然后用毛刷薩取PVY接种物轻轻刷在摩擦后的叶片上。 2.7.数据调查:选择发病最重的时间，调查P VY的发病率和病级。 病级按如下标准调查： 0级:全株无病或出现极轻微花叶。 1级：1 /1 0到1 /3的叶片表现轻微小叶脉坏死或出现点刻状条斑症状W及轻微变 形，整株其他叶片无症状，植株无明显矮化。 2级：1 /3到1 /2的叶片表现点刻状条斑或脉坏死，病叶大部分小叶脉坏死，造成叶片 较大面积的黄化、枯死，植株矮化为正常株高的2 /3W上。 3级：1 /2到2/3的叶片表现较严重的脉坏死或2 /3 W上的叶片出现点刻状条斑坏 死，单叶较大面积的枯死，少部分叶片脱落。或整株叶片开始变黄。
[0021] 4级：全株叶片表现严重的脉坏死或叶片变形、萎缩，2 /3左右的叶片萎黨脱落， 病株矮化为正常烟株的1 /2至1 / 3，或整株调萎。 病情指数DI = [Σ(各级病株株数X该病级值）/(调查总株数X最高级值）]X 100 二、实验结果 TCTP超量表达株系02、07; TCTP沉默株系化16、Ri 20。
[0022] 1.化TCTP基因在不同株系中的表达验证 通过Western杂交验证表明，2个沉默载体株系，Ril6和Ri20中TCTP基因都没有表达，说 明已经成功沉默，而2个超量表达的株系02和07表达量均超过对照(WT)，说明超量表达也是 成功的（图1)。
[0023] 2.化TCTP基因超量表达和沉默株系抗病性鉴定结果 接种14天后调查病情，2个沉默株系Ri 16和Ri20均表现免疫，未发病，抗病性有很大提 高，而超量表达的株系02和07均表现出比对照更严重的坏死症状，病情更为严重(图2)。
[0024] W上结果表明，在烟草中沉默tc化基因能够提高植物对PVY的抗病性，该基因具有 重要的应用价值。
[00巧]3.结论 烟草翻译控制肿瘤蛋白基因（NtTCTP)能够明显提高烟草对PVY的抗性，具有较强的应 用前景。
[0026] 4.附录 烟草烟草翻译控制肿瘤蛋白基因的核酸序列及其编码的氨基酸序列。
[0027] 序列表
【主权项】
1. 一种烟草基因 NtTCTP，其特征在于:具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。2. 如权利要求1所述的一种烟草基因 NtTCTP编码的蛋白质，其特征在于：具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。3. 如权利要求1所述的一种烟草基因 NtTCTP用于调节烟草对PVY的抗性。
【专利摘要】本发明公开了一种烟草基因NtTCTP，其特征在于：具有SEQ？ID？NO:1所示的核苷酸序列；其编码的蛋白质，具有SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列，该基因用于调节烟草对PVY的抗性。
【IPC分类】C12N15/29, C07K14/415
【公开号】CN105586346
【申请号】CN201510858859
【发明人】郭玉双, 张劲松, 陈受宜, 贾蒙骜, 任学良, 赵杰宏
【申请人】贵州省烟草科学研究院
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月1日