一种小麦抗旱、耐盐基因TaPIP1A及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因工程技术领域，具体地说是一种小麦抗旱、耐盐基因化PIP1A 及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 目前全球水资源短缺，在有限的±地资源前提下有效的农业耕种显得尤为重要。 非生物胁迫对农作物的产量影响较大，在各种非生物胁迫中，旱胁迫和盐胁迫经常引起植 物细胞脱水、离子平衡被打破，进而导致农作物产量降低，运就要求固定根生植物面对各种 外界逆境胁迫因素，必须具备与胁迫因素相适应的应激机制W降低胁迫伤害。因此，植物在 各种胁迫下维持其水分平衡的机理一直是抗逆研究的热点，也是通过基因工程培育耐盐抗 旱农作物新品种的研究基础。
[0003] 水通道蛋白是一类高效转运水分子的整合膜蛋白，在植物水分转移过程中起着重 要作用。水分在植物体内运输有Ξ种途径:质外体途径、共质体途径和跨细胞途径。水分的 跨膜运输有Ξ种方式:通过脂双层(胞膜）的自由扩散运输、通过膜转运蛋白的运输和通过 水通道蛋白的被动运输。目前通常将植物水通道蛋白分为四类:位于质膜上的质膜内在蛋 白PIPS、位于液泡膜上的液泡膜内在蛋白TIPs、存在于共生根瘤类菌体周围膜上Nod26类、 小分子碱性膜内在蛋白SIPs。目前，人们已对烟草等作物的水通道蛋白做了一些相关的研 究，但是小麦的水通道蛋白功能及作用机制的研究却很少。小麦是全球重要的粮食作物之 一，其抗旱或/和耐盐研究日益受到人们的关注。因此，研究小麦在干旱和盐胁迫下其与胁 迫因素相适应的应激机制的相关基因，并利用相关基因的特性培育小麦及其他植物抗旱耐 盐新品种，对农业发展具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种小麦抗旱、耐盐基因化PIP1A及其编码蛋白和应用，为农 作物抗旱耐盐新品种的研究和培育提供候选基因，W培育更多抗旱耐盐植物新品种。
[0005] 本发明是运样实现的：一种小麦抗旱、耐盐基因化PIP1A，所述基因化PIP1A的cDNA 序列如SEQ ID NO : 1所示;所述基因化PIP1A的曲ΝΑ序列如沈Q ID NO : 2所示，其曲ΝΑ由 3个外显子和2个内含子组成;从5 '端开始，夕F显子的长度依次为64化Ρ、14化Ρ、96bp，内含子 长度依次为129bp、ll化P。
[0006] 本发明还公开了一种小麦抗旱、耐盐基因 TaPIPlA的编码蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 3所示;该基因化PIP1A的编码蛋白是一种定位于细胞质膜的小麦水通道蛋白 质。
[0007] 本发明还公开了一种重组质粒，所述重组质粒包含权利要求1所述的小麦抗旱、耐 盐基因 TaPIPlA;该质粒的载体优选为PCAMBIA1300,即重组质粒优选为PCAMBIA1300- 化PIP1A，此外，任何一种可W将外源基因导入植物中表达的载体都可W用于本发明。
[0008] 本发明提供的小麦抗旱、耐盐基因化PIP1A在选育抗旱耐盐植物品种中的应用，该 植物优选小麦或拟南芥。
[0009] 具体应用方法为:将所述小麦抗旱、耐盐基因化PIP1A或者将含有小麦抗旱、耐盐 基因 TaPIPlA的重组质粒导入宿主小麦或拟南芥的细胞、组织或器官中，培育得到具有抗 旱、耐盐小麦或拟南芥新品种。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可W对含有所述 基因 TaPIPlA的植物表达载体pCAMBIA1300-TaPIPlA进行加工，可W加入选择标记，如GUS 绝 〇 〇
[0010] 本发明所用科农9204化N9204)为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审 定委员会审定;2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。
[0011] 本发明应用了植物基因工程技术，首次从小麦科农9204中获得基因化PIP1A，通过 实验证明，该基因化PIP1A通过农杆菌介导的方法将该基因转入植物(拟南芥）中，该转基因 能够使植物(拟南芥)具有较强的抗旱耐盐能力，运为农作物耐盐抗旱新品种的研究和培育 提供了良好的候选基因，对实现培育抗旱耐盐植物新品种具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0012] 图1为小麦基因 TaPIPlA的cDNA序列及曲NA序列的扩增结果。Μ为DNA Markerlll (天根生化科技有限公司，北京）。
[001引图2为转基因 TaPIPlA拟南芥阳性植株的分子检测结果。
[0014] 图3为转基因化PIP1A拟南芥在种子萌发期耐盐性和耐旱性的表型鉴定结果。
[0015] 图4为转基因化PIP1A拟南芥在干旱和盐胁迫下种子萌发率统计结果。
[0016] 图5为转基因化PIP1A拟南芥在苗期的耐盐性鉴定结果。
【具体实施方式】
[0017] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材 料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重 复实验，结果取平均值。文中的Μ表示mol/L。
[0018] 实施例1小麦化PIP1A基因的克隆 1、提取小麦总RNA (1) 将科农9204的组织材料放入液氮预冷的研鉢中，在液氮中充分研磨成粉末； (2) 待液氮挥发干，立即转移到2ml的离屯、管中，每lOOmg材料约加入1ml的Invitrogen 公司的Trizol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使其充分裂解，室溫 放置5分钟； (3) 加入0.2ml氯仿（chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室溫放置10分钟；在4°C下， 12000巧m离屯、15分钟； (4) 小屯、吸出上层水相，加入到干净的1.5ml的离屯、管中，加入50化1的异丙醇(上层水 相与异丙醇的体积比为1:1)，充分混匀，在-20°C下，沉淀30 min;在4°C下，12000 rpm离屯、 10 min,小屯、弃去上清液，留沉淀； (5) 将沉淀用1 ml的体积百分比浓度为75%的乙醇溶液洗涂，在4°C下，8000 rpm离屯、10 min,收集RNA沉淀； (6) RNA沉淀于无菌操作台上惊干约10-15分钟，当RNA略显透明，加入50 μ1的RNase- 打ee水充分溶解，可放于-80°C下长期保存，备用； (7)用紫外分光光度计及质量百分比浓度为1%的Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
[0019] 2、cDNA 反转录 按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒(TaKaRa, DRR019A)的说明书进行;首先进行 第一步反转录反应，W500 ng的RNA为模板进行反转录，按照所述说明书指示在反应体系 中依次加入由MgCl2、10XRT buffe;r、RNase Free 地2〇、dNTP Mixture、RNase InWbitor、 AMV Reverse Transcriptase、01igo dT Primer和Total RNA组成的反应体系共 10 化。反 应程序为:42°C 30 min,99°C 5 min,5°C 5 min。
[0020] 3、克隆和序列测定 (1似cDNA为模板，在5 ' UTR和3 ' UTR设计基因特异引物，引物序列分别为： 上游引物Xbal-PIPIA: 5 ' -GCTCTAGATCTCTCCCAAAGCCAAGAGC-3 '，下游引物BamHI- PIP1A:5 '-CGGGATCCCAGCGATAAGATTCCACCCG-3'； (2) PCR反应体系(共20化）： 2XTaq PCR MasterMix 10 μL 上游引物Xbal-PIPIA 0.5化 下游引物BamHI-PIPlA 0.5化 模板cDNA 1化 d地2〇 8化 (3) PCR反应程序:94°C预变性5 min;94°C变性30 sec，58°C退火30 sec，72°C延伸 1 minl5s，30循环/min;72°C延伸7 min;2(TC保存，扩增得到的特异扩增条带如图1所示； 回收PCR产物连接pEASY-Blunt cloning vector(全式金生物技术有限公司）进行测 序，扩增得到的PCR产物的核巧酸序列为SEQ ID NO : 1，其起始密码子到终止密码子的大 小为879 bp，该PCR产物的基因命名为化PIP1A，该基因化PIP1A的编码蛋白的氨基酸序列如 沈Q ID NO : 3所示。
[0021 ] 实施例2 TaPIPlA基因组曲NA全长克隆 (1)曲NA提取:按照植物曲NA提取试剂盒说明书(天根生化科技有限公司，北京)方法提 取科农9204小麦曲NA; (2 ) W科农9204的曲NA为模板，在5 ' UTR和3 ' UTR设计基因特异引物，上下游引物如下： 上游引物Xbal-PIPIA:5'- GCTCTAGATCTCTCCCAAAGCCAAGAGC -3'， 下游引物BamHI-PIPlA:5'- CGGGATCCCAGCGATAAGATTCCACCCG -3'； 进行PCR扩增，扩增条件同实施例1扩增cDNA的操作步骤。将得到的特异扩增条带如图1 所示，连接pEASY-Blunt cloning vector并测序，得到了基因 TaPIPlA在科农9204中的全长 曲NA序列，从起始密码子到终止密码子大小为1124 bp。
[0022] 由于实施例中cDNA的开放阅读框大小为879 bp，其曲ΝΑ从起始密码子到终止密码 子的大小亦为1124 bp，通过核巧酸序列比对显示，基因化ΡΙΡ1Α的曲ΝΑ由3个外显子和2个 内含子组成；从5'端开始，夕F显子的长度依次为642bp、141 bp、96bp，内含子长度依次为 129bp、ll化P。
[0023] 实施例3重组质粒pCAMBIA1300-TaPIPlA的获得 (1)用限制性内切酶Xba I和BamHI对由实施例1得到分子量为879bp的PCR产物（基因 TaPIPlA)进行双酶切，其双酶切体系为:Xbal 1μ1，BamHI化1，10 X buf f erK 1μ1，PCR产物化 1，dd出Ο 1化1，得化PIPIA基因的酶切产物； (2) 用内切酶Xbal和BamHI对质粒PCAMBIA1300双酶切，其双酶切体系:Xbal 1μ1，BamHI 1 yiaOXbufferK化1，质粒化l，dd出Ο 1化1，获得PCAMBIA1300的酶切产物； (3) 分别