抗草甘膦epsps基因的筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体而言，设及一种抗草甘麟EPSPS基因的筛选方法及 其应用。
【背景技术】
[0002] 民oundup"是目前世界上使用的最为广泛的除草剂之一，至今已使用了近四十 年，草甘麟是其主要的活性成分。草甘麟是憐酸締醇式丙酬酸(PEP)的类似物，与PEP竞争5- 締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶化PSPS)的活性位点，进而抑制EPSPS的活性。EPSPS在莽草 酸途径（shikimate pathway)中催化阳P和莽草酸-3-憐酸醋合成EPSP，草甘麟最终导致莽 草酸代谢途径的合成受阻，使其不能持续合成芳香族胺基酸如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸 等，让许多二次代谢物，诸如木质素、叶黄素类、生物碱等，因缺少芳香族胺基酸而无法合 成，进而影响植物正常生长，终致死亡。
[0003] 廉价、高效、低残留使草甘麟得W广泛应用，但是草甘麟没有选择性，它在杀死杂 草的同时对农作物也具有同样的毒害作用。因此若想要在农作物种植时选择性的杀死杂 草，则需要使农作物获得抗草甘麟的能力。
[0004] 使农植物获得抗草甘麟能力有Ξ种主要途径:EPSPS过量表达、引进草甘麟降解酶 或者引进对草甘麟有抗性的EPSPS突变体。在早期的研究中，过量表达EPSPS可得到一定的 草甘麟抗性。然而多数情况下在植物中过量表达野生型的EPSPS并不能赋予植物对草甘麟 的耐受性，运使得此方法目前没有在生产中得W应用。在长期受草甘麟污染的环境中，有的 细菌可降解草甘麟，并已成功分离到草甘麟降解基因 G0X基因。但有研究标明G0X基因对草 甘麟的降解产物AMPA的积累会对大豆产生中等程度的毒性。
[0005] 目前生产上用得最多的还是能抗草甘麟的EPSPS。多年来，许多研究者从不同的微 生物中发现了一些具有不同抗性程度的EPSPS基因。早期工作用EMS使EPSI^基因突变，并用 间接的方法筛选到能抗草甘麟的EPSI^基因。最著名的CP4-EPSPS来自细菌用草甘麟作为能 量来源的能力筛选，运种筛选是选择细菌降解草甘麟的能力，碰到能抗草甘麟的EPSPS，多 少有些幸运。近年来，先后从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、盐单胞菌化alomonas variabilis)、人苍白杆菌（Ochrobactrum ant虹opi)、水生拉恩菌（Rahnella aquatilis)、 奇艺变形杆菌（Proteus mirabilis)、脱氮副球菌（Paracoccus denihificans)等微生物 中分离出了具有不同抗性程度的EPSPS。但运些研究工作采用的方法都是在采集样品中分 离微生物菌株，再分别对运些微生物菌株进行草甘麟抗性筛选，对其进行鉴定并克隆其 EPSPS基因，进一步对其EPSPS基因进行功能验证。用运样的方法来筛选抗草甘麟基因，需要 耗费大量的人力和物力，且筛选的效率不高。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种抗草甘麟EPSPS基因的筛选方法，运用此种方法 筛选抗草甘麟基因，不用对分离的个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短 时间内筛选得到较多的抗草甘麟基因。
[0007]本发明的第二目的在于提供一种基于所述抗草甘麟EPSPS基因的筛选方法筛选到 的抗性基因的应用，一方面，将运些基因在转入农作物后其草甘麟抗性可在短时间内得到 评估，另外也可W快速培育抗草甘麟植物品种。
[000引一种抗草甘麟EPSPS基因的筛选方法，包括如下步骤：
[0009] 1)、将含有草甘麟抗性微生物的多种微生物在含有草甘麟的抗性的筛选培养基中 进行筛选培养，得到抗性菌种，并对其纯化培养获得单克隆；
[0010] 2)、W所述单克隆的基因组为模板扩增该单克隆的EPSPS基因的开放阅读框序列， 将扩增产物连入质粒中并于细菌中进行原核表达，得到重组菌株；
[0011] 3)、对重组菌株的草甘麟抗性进行验证，获得抗草甘麟EPSPS基因。
[0012] 根据具体语境，EPSPS可为5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶的基因或该基因表达 的蛋白。
[0013] 本发明针对现有的抗草甘麟基因筛选方法中存在的不足，提供了一种快速而有效 地高通量筛选抗草甘麟基因的方法，运用此种方法筛选抗草甘麟基因，不用在筛选前分离 菌株和对个别菌株筛选，较传统方法目标性强，操作简便，可在短时间内筛选得到较多的抗 草甘麟基因。
[0014] 优选的，如上所述的筛选方法，在步骤1)中，所述培养的具体过程为：
[0015] 将微生物样本于含有草甘麟的抗性筛选培养基中培养1~10次，且培养次数大于1 次时，在每相邻两次培养所用抗性筛选培养基中，后一次培养的草甘麟浓度均不低于前一 次，且后一次培养的菌种来源于前一次培养中存活下来的微生物菌种。
[0016] 用此方法可筛选到针对不同浓度草甘麟敏感的菌种，亦即该体系能够快速筛选出 不同程度的抗草甘麟的EPSI^基因。
[0017] 进一步优选的：
[001引在步骤1)中，草甘麟含量的范围为20~500mM，相邻浓度梯度设置的间距为1.5~5 倍；
[0019] 在步骤3)中，抗性验证具体包括步骤1)中筛选到的抗性菌种的草甘麟浓度为 最高浓度，设置草甘麟浓度为1~500mM的浓度梯度，将步骤3)中所述重组菌株于草甘麟含 量梯度设置的抗性筛选培养基中培养，W筛选抗草甘麟EPSI^基因。
[0020] 相邻浓度梯度设置的间距为1.5~5倍的含义即后一次培养中培养基的草甘麟浓 度是前一次培养中培养基的草甘麟浓度的1.5~5倍。
[0021] 由于理论上重组菌株的草甘麟抗性不会高于抗性菌种的草甘麟抗性，所抗性 菌种的草甘麟浓度为最高浓度。例如筛选到的抗性菌种能够耐受的最高草甘麟浓度为 50mM，则在步骤3)中，抗性筛选培养基的浓度梯度可设置为ImM、5mM、lOmM、20mM、50mM。在具 体的应用中，步骤3)中用到的抗性筛选培养基可能与步骤1)中略有不同，如在步骤1)中提 供的抗性筛选培养基配方的基础上加上重组菌株所具有抗性对应的抗生素。
[0022] 优选的，如上所述的抗草甘麟EPSPS基因的筛选方法，所述抗性筛选培养基的包括 W下组份：
[0023] Na2HP〇4l3~14g/L、K此P0巧.7~6.3g/L、NaCl 0.9~l.lg/L、NH4Cl 1.8~2.2g/L、 葡萄糖37~43g/L、MgS〇4 · 7出0 48~52g/L、CaCl221 ~23g/L、草甘麟20~500mM;溶剂为水。
[0024] 如上所述的抗草甘麟EPSI^基因的筛选方法，在步骤2)中：
[0025] 当所述单克隆种属未知时，则扩增所述单克隆的部分16s rRNA序列，并将扩增产 物测序W确定所述单克隆种属；
[0026] 根据得到的种属信息查询所述单克隆的EPSPS基因序列并W此为模板设计引物扩 增得到具有草甘麟抗性的EPSI^基因片段并测序；
[0027] 根据测序结果设计引物，将所述具有草甘麟抗性的EPSPS基因的开放阅读框序列 连入质粒中并于细菌中进行原核表达。
[00%] 16s rRNA普遍存在于所有细菌染色体基因中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中其基因序列较为保守，变 异较小，可看作为生物演变的时间钟，其可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保 守，所W可利用恒定区序列设计引物，将16s rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来 对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。扩增16s rRNA的引物如：
[00 巧]ht1:ps: //en. wdkipedia. o;rg/w;Lki/16S_;ribosoma