，阳性率高。该基因 的成功克隆为研究福寿螺的溫度胁迫提供了科学依据。
[0030] 本发明快速、有效、重复性强，是对海藻糖合成酶基因家族的重要补充。福寿螺为 重要的入侵生物，本发明有助于开发海藻糖合成酶及海藻糖酶抑制剂的新型生物农药，通 过阻断生物体内海藻糖的分解和合成来达到控制福寿螺入侵的目的。本发明对福寿螺生物 学、生态学、新型杀虫剂的研究与测定及福寿螺对低溫耐受性的抗性机制研究均具有重要 意义。
【附图说明】
[0031 ]图1为扩增得到的福寿螺WS基因中间片段；
[0032] 图2为福寿螺WS基因的5 ' -RACE片段；
[0033] 图3为福寿螺WS基因的3 ' -RACE片段；
[0034] 图4为福寿螺WS基因的系统发育树；
[0035] 图5为不同溫度胁迫下，不同组织的WS表达情况；
[0036] 图6为低溫胁迫下，福寿螺WS基因在福寿螺不同组织中的表达情况；
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。W下实施例中，未提及的材料、 方法或其他技术特征均与
【发明内容】
中记载一致。
[003引实施例1.福寿螺肌肉组织总RNA的提取及cDNA的合成
[0039] (1)取新鲜福寿螺肌肉组织50mg-100mg用DEPC水冲洗3-5次，迅速置于液氮中保 存；
[0040] (2)在液氮条件下将福寿螺肌肉组织研磨成细粉状，然后采用化izol试剂提取福 寿螺肌肉组织的总RNA;
[0041 ] (3)利用生工生物M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒合成福寿螺肌肉组织的cDNA.保 存于-20°C备用。
[0042] 实施例2.福寿螺WS基因兼并引物的设计
[0043] 在NCBI数据库中捜索TPS基因的氨基酸序列，选择不同物种的TPS氨基酸序列，然 后利用CODE册P程序设计兼并引物。
[0044] 利用C0DEH0P设计引物的主要步骤如下：保存上面查询到的不同物种的氨基酸序 列为 FASTA 格式，并将结果提交到 BlockmakeHhttp ://blocks. fhcrc. org/blocks/make_ blocks.html)，进行保守区的查找，之后将得到的保守区提交到服务器进行引物的设计，设 计的主要参数为，简并度（Degeneracy) 128 ;退火溫度（Temperature)为60°C ;遗传密码 (Genetic code) :s化ndard，尽量选用简并度小，化值及目的片段长度合适的引物送公司合 成。设计的引物序列如下：
[0045] 上游引物 UP1:5 ' -TCCACgay^ycay}rt-3 '
[0046] 下游引物 UP2:5 ' -CCTTGGCCACCAGGttcatncCTtc-3 '
[0047] 注:η为A、T、C或 G;y为C或 T;r 为A或 G
[004引同时设计3'-RACE和5'-RACE引物，序列如下：
[0049] TPS3F:5'-CGCTCAGGTCGTAGTAGCAGAAGGTC-3 '
[0050] TPS3R：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'
[0051 ] TPS5F:5'-GGCTTCTTTCTTCACATTCCGTTCCC-3'
[0052] TPS5R 5'：-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3'
[0053] 实施例3.福寿螺TPS基因的分离
[0054] 用设计好的兼并引物对UP1，UP2进行PCR扩增，得到738bp的TPS中间片段（图1)。该 中间片段在GeneBanK的登录号为KR821168.1.
[0055] PCR反应体系为25化：10乳Taq buffer 2.化L，dNTPs(各 10nmol/L)0.5化，MgCb (25mM) 1.扣L，cDNA 1化，Taq酶0.化L，力日d地20水补齐至25化。？0?反应程序为：94°C预变性 3min;然后 941：3〇3,551：3〇3,72°(：1111111，30个循环；72°(：延伸10°(：。
[0化6] 用TPS5F，TPS5R引物对，扩增获得2048bp的5 '端片段（图2)。
[0化7] 用TPS3F，TPS3R引物对，扩增获得42化P的3 '端片段（图3)。
[005引将上述扩增获得片段利用DNAman软件进行拼接，获得全长2152bp的福寿螺TPS基 因全长序列。SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2分别提供的就是此全长基因 ORF的氨基酸序列及 核巧酸序列
[0059] GeneBanK登记的登录号为KR821168.1的中间片段的序列具体为：
[0060]
[0061] 实施例4.福寿螺WS基因的系统发育树分析
[0062] W福寿螺TPS和其他物种的TPS氨基酸序列为基础，利用MEGA6.0软件构建系统进 化树如图4。在进化树中，节肢动物，植物，甲壳类动物、无脊椎动物的ITS序列各自分开并且 形成紧密相关、高度可信的簇，福寿螺海藻糖合成酶基因 TPS归于无脊椎动物的簇，说明他 们由相同的基因复制而来。
[0063] 实施例5.不同溫度胁迫下，不同组织的ITS表达情况分析及TPS的时空表达模式分 析
[0064] 提取不同组织的总RNA，利用qPCR检测TPS基因在不同溫度胁迫下的组织表达情 况。反应体系为25化。反应程序为:95 °C预变性Imin;然后95 °C 10s，63 °C 25s，45个循环;说有 数据使用Excel 2010进行统计分析。按照Ct的方法(2-aau method)分析TPS基因的相对表 达水平。所有数据均W平均值±SE的形式标注.结果见图5,图6。从图5可W看出，在热激条 件下，和对照相比，TPS在肌肉组织中的表达量轻微下降，在其他组织的表达没有变化。在冷 激条件下，和对照相比，TPS在所有的检测组织中表达量都上升明显(P<0.01)，其中，足部肌 肉组织表达量最高，大约是消化腺的2倍，肾脏的1.5倍，觸的1.3倍。
[0065] 从图6可W看出，在冷激条件下，TPS在所检测的组织中的表达量先上升后下降，最 后趋向正常值，说明，在短时冷应激的条件下，TPS基因是福寿螺的冷激代谢产物，对于提高 福寿螺的低溫耐受性具有重要作用。
【主权项】
1. 一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因，其特征在于，该基因具有（i)或（ii)所 述核巧酸序列之一： (i) 序列表中的SEQ ID NO:2或者其N-端缺失3-150个核巧酸残基且具有相同开放阅读 框的DNA序列； (ii) 与（i)限定的DNA序列具有90%-95% W上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序 列。2. -种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质 具有(i)或（ii)所述氨基酸序列之一： (i) 具有序列表中SEQ ID NO: 1或其N-端缺失1至50个氨基酸残基的氨基酸序列； (ii) 在（i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加1至23个氨基酸且具有调控淡水 软体动物抗逆性功能的由（i)衍生的蛋白质。3. -种如权利要求1所述基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 取新鲜福寿螺肌肉组织SOmg-IOOmg用DEPC水冲洗3-5次，迅速置于液氮中保存； 2) 福寿螺肌肉组织的总RNA提取:在液氮条件下将福寿螺肌肉组织研磨成细粉状，然后 转移到含有0.3-0.5mL细胞裂解液的离屯、管中；提取福寿螺肌肉组织的总RNA; 3) 反转录合成福寿螺肌肉组织的CDNA; 4) 利用CODE册P程序设计兼并引物； 5) 利用步骤4)设计的兼并引物，PCR扩增海藻糖合成酶基因中间片段CDNA序列； 6) 克隆福寿螺TPS基因的3，端和5，端CDNA序列； 7) 将步骤5)和6)中获得的S个CDNA片段拼接获得TPS基因的全长序列。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细胞裂解液组成为： 异硫氯酸脈 24重量份， 十二烷基硫酸钢 0.4重量份， 尿素 0.4重量份， 氯化钢 0.2麗量愤， 加入25重量份DEPC水，定容至50体积。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的兼并引物序列为：上游引物5'- 1 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件为94°C预变性3min;然后94°C 3〇3,551：3〇3,72°(：1111111，30个循环;72°(：延伸10°(：。
【专利摘要】本发明公开了一种福寿螺抗逆相关基因海藻糖合成酶基因(Trehalose-6-phosphate？synthase,TPS)、其编码的蛋白质及其克隆方法，属于生物技术领域。本发明还公开了这种海藻糖合成酶基因的用途，尤其是在福寿类入侵过程中提高福寿螺的低温耐受性.本发明的蛋白及其编码基因对于外来入侵生物福寿螺抗逆机制的研究具有重要的理论及实际意义。
【IPC分类】C12N15/54, C12N9/10, C12N15/10
【公开号】CN105586354
【申请号】CN201610122025
【发明人】刘光富, 俞晓平, 张蓬军, 申屠旭萍, 许益鹏, 杨倩倩, 郝培应
【申请人】中国计量学院
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年3月3日