一种同时表达小分子rna和蛋白质的双功能慢病毒表达载体及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种慢病毒表达载体及其制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 基因是指能表达有功能的产物(如RNA和蛋白质）的DNA序列，是遗传的基本单位。 因此，基因的表达决定着生物体的生长，发育，衰老和疾病的发生等生物过程。人类基因组 包含了编码蛋白的3万多个基因 W及编码了 3万W上的微小RNA和长链非编码RNA。每个基因 在细胞的生命活动中起什么样的作用目前还不完全清楚。现代分子生物学主要内容之一是 利用分子生物学技术手段研究基因在细胞生理生化过程中的作用及其作用机理。
[0003] 目前，在细胞水平研究基因功能的过程中最为常用的方法是将特定基因的表达降 低或升高，或者完全敲除来研究它对细胞的生化和生理活动的影响。研究者为了使特定基 因的表达升高或将降低，需要分别将该基因或干扰该基因表达的DNA片段克隆到表达载体 上并转染细胞。表达载体分瞬时表达载体和慢病毒表达载体，而慢病毒载体更具优势，因为 它能获得稳定表达的细胞系，目前它在研究中应用比较广泛。因此，表达载体的优劣决定着 研究的进展速度和效率。目前，虽然生物技术市场上供应了各种慢病毒表达载体并产生了 许多经济效益，但也存在许多不足或缺陷。
[0004] 比如，目前采用的蛋白慢病毒过表达载体，用于编码蛋白的基因（或叫祀基因）在 细胞内过表达，即将祀基因克隆在表达蛋白的慢病毒蛋白表达载体（如PLV-U6-EGFP- 化ro)，转染动物细胞进行过表达，研究蛋白过表达的作用。该技术存在如下缺点:a.不能表 达小分子RNA包括shRNA, S i RNA, gui de RNA; b.可选择的用于克隆基因的酶切位点少，而包 含常用的限制性酶切位点更少，或者由于载体太大，不方便基因克隆；C.不能用于CRISPR- cas9基因编辑敲除基因的研究;d.不能在敲低内源基因的同时研究基因突变的功能。
[0005] W及目前采用的小分子RNA慢病毒表达载体，用于表达小分子干扰RNA(siRNA或 shRAN)，guide RNA等，即将编码小RNA的DNA片段克隆到慢病毒小分子RNA表达载体，转染细 胞，筛选稳定表达该RNA的细胞系，研究RNA表达对细胞的影响。该技术存在W下缺点:a.不 能表达编码蛋白的基因；b.可选择的用于克隆基因的酶切位点少，包含常用的限制性酶切 位点更少，或者由于载体太大，不方便基因克隆；C.不能用于CRISPR-cas9基因编辑敲除基 因的研究;d.不能在敲低内源基因的同时研究基因突变的功能。
【发明内容】
[0006] 本发明目的之一是提供一种分子量小且方便克隆的、具有多克隆位点的慢病毒表 达载体。
[0007] 本发明目的之二是提供一种既可表达小分子RNA又可W表达蛋白的慢病毒表达载 体。
[0008] 本发明目的之Ξ是提供一种可同时表达小分子RNA和蛋白质慢病毒表达载体。
[0009] 具体的，本发明提供了一种慢病毒表达载体，其特征在于其核巧酸序列如SEQ ID NO: 4所示，W及将慢病毒表达载体转染细胞W表达RNA或蛋白的应用，W及在于将所述慢病 毒表达载体转染细胞同时表达RNA和蛋白的应用。
[0010] 同时，本发明还提供了一种核巧酸序列SEQ ID N0:4所述载体的制备方法，包括W 下步骤：
[0011] (1)W序列表SEQ ID N0:5和序列表SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列为引物，对 pLV-U6-EGFP-puro载体的化〇巧日Xbal酶切位点进行突变，pLV-U6-EGFP-puro载体的核巧酸 序列如序列表SEQ ID NO: 1的核巧酸系列所示;得到突变的pLV-U6-EGFP-puro载体，所述突 变的pLV-U6-EGFP-puro载体的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 2的核巧酸系列所示；
[0012] (2)根据载体全序列酶切图谱分析结果，设计并合成一段包含多克隆位点的DNA序 列，在步骤（1)制备的突变的pLV-U6-EGFP-puro在的U6启动子下游的BamHI和EcoRI酶切位 点之间，插入多克隆位点序列，所述多克隆位点序列的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 3的 核巧酸系列所示；得PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体，所述PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体的核 巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 11的核巧酸系列所示；
[001引 （3似序列表SEQ ID N0:7和序列表SEQ ID N0:8所示的核巧酸序列为引物，在步 骤(2)制备的PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体的第24个核巧酸至25个核巧酸之间插入CMV启动 子，得到权利要求1所述的核巧酸序列如SEQ ID N0:4所示的慢病毒表达载体。
[0014] 此外，本发明还提供了一种慢病毒表达载体，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO: 2所示，W及将所述慢病毒表达载体转染细胞W表达RNA的用途。
[0015] W及，本发明还提供了一种慢病毒表达载体，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO: 11所示，W及将所述慢病毒表达载体转染细胞W表达RNA的用途。
[0016] 所述转染细胞是指与病毒包装辅助载体共转染，所述病毒包装辅助载体为:PH1与 P肥。
[0017] 另一方面，本发明还提供了一种慢病毒表达载体，其特征在于由W下步骤制备得 到：
[001引（1)W序列表SEQ ID N0:5和序列表SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列为引物，对 pLV-U6-EGFP-puro载体的化0巧日Xbal酶切位点进行突变，pLV-U6-EGFP-puro载体的核巧酸 序列如序列表SEQ ID NO: 1的核巧酸系列所示;得到突变的pLV-U6-EGFP-puro载体，所述突 变的pLV-U6-EGFP-puro载体的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 2的核巧酸系列所示；
[0019] (2)根据载体全序列酶切图谱分析结果，设计并合成一段包含多克隆位点的DNA序 列，在步骤（1)制备的突变的pLV-U6-EGFP-puro在的U6启动子下游的BamHI和EcoRI酶切位 点之间，插入多克隆位点序列，所述多克隆位点序列的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 3的 核巧酸系列所示；得PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体，所述PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体的核 巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 11的核巧酸系列所示；
[0020] (3)w序列表SEQ ID N0:7和序列表SEQ ID N0:8所示的核巧酸序列为引物，在步 骤(2)制备的PLV-U6-MCS--EGFP-化ro载体的第24个核巧酸至25个核巧酸之间插入CMV启动 子，得到核巧酸序列如SEQ ID N0:4所示的慢病毒表达载体。
[0021 ]本发明通过对原载体pLV-U6-EGFP-puro全测序，得到了该载体的完整DNA序列;并 突变了原载体pLV-U6-EGFP-puro中的趾〇1和Xbal酶切位点，获得了突变的PLV-U6-EGFP- puro的DNA序列。在突变后的载体的技术上，插入包含更多酶切位点的多克隆位点序列 (MCS)，得到包含多个酶切位点的新的表达RNA的慢病毒表达载体。在包含多个酶切位点的 新的表达RNA的慢病毒表达载体的No11和趾01酶切位点之间，插入CMV启动子，得到了具有 RNA和蛋白质双功能表达的新型载体。
[0022] 本发明技术方案带来的有益效果：
[0023] 1.用本发明制备的慢病毒表达载体具有质量小且方便克隆特点，能提高研究中的 工作效率。
[0024] 2.用本发明制备的慢病毒表达载体既表达小分子RNA又可W表达蛋白，避免了研 究者为了不同功能的研究同时购买两个不同功能的慢病毒表达载体，减少研究者的工作 量，节约了研究开支。
[0025] 3.用本发明制备的慢病毒表达载体可同时表达小分子RNA和蛋白质，可W拓宽研 究的内容，例如1)通过表达外源修饰并突变的基因，同时干扰内源基因的表达，W研究基因 突变的功能;2)同时表达小分子指导RNA(Guiding RNA)W及化s9剪切酶对细胞内源基因进 行敲除，研究基因的功能。此为近年来新兴的基因编辑技术，我们的载体为用户提供了此种 功能。
[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想的前提下，还可W做出其他多种形式的修改、替换或者变更。
[0027] W下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容在做进一步的详细说 明，但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容所实 现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】：
[002引图1 a、原载体化V - U6 - EGFP -化r0的初级结构示意图。线状构图，原载体化V - U6 - EGFP-Puro包含关键调控原件和编码的筛选基因等。
[0029] 图化、本发明制备的新的双功能表达载体化V - U6 - CMV - EGFP - Pur0初级结构示意 图。
[0030] 图2A、pLV-U6-EGFP-Puro突变前的酶切分析。结果表明，它包含趾〇1和Xbal酶切位 点，不含Notl位点。酶切鉴定分析表明突变是成功的。
[0031 ] 图2B、pLV-U6-EGFP-Puro的化〇1和Xbal酶切位点突变后的酶切分析。结果表明，它 不含Notl，化〇1和甜al酶切位点。酶切鉴定分析表明突变是成功的。
[0032] 图3A、含多个克隆位点的载体pLV-U6-MCS--EGFP-Puro酶切鉴定。酶切鉴定结果显 示，该载体能被BamHI、NotI、化oI、XbaI、EcoRI切成W-条带，说明载体只含运些酶的一个 酶切位点。其它没有检测的酶切位点化al，化e I，Sma I，Bcl I，用测序方法验证(见下图 3B)。
[0033] 图3B、载体PLV-U6-MCS--EGFP-P