一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产柠檬酸的方法
【专利说明】-种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产梓樣酸的方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于发酵工程技术领域，尤其设及一种基于抑响应阶段添加糖化酶发酵生 产巧樣酸的方法。
【背景技术】
[0003] 巧樣酸(Citric Acid)是一种具有多种功能的重要有机酸，广泛应用于食品、医 药、化工等领域，是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸，全球产量超过170万吨。 同时，巧樣酸又具有优良的生物特性，在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域 有巨大的应用潜力，其需求量W每年5%的速度增长。
[0004] 巧樣酸往往通过液态深层发酵法获得，工业化生产中仍然沿用传统的分批发酵方 式。因黑曲霉具有酶系丰富、底物广泛、产率高等优势，是巧樣酸发酵最重要的菌株，黑曲霉 自身能够分泌糖化酶，一般采用边糖化边发酵的方式。但在黑曲霉发酵生产巧樣酸过程中， 随着合成的巧樣酸不断积累，发酵液pH会显著下降，糖化酶活性逐步受到抑制，致使终发酵 膠液中残糖偏高，发酵周期较长。
[0005] 现有技术针对巧樣酸发酵过程的糖化作用进行了一些研究。申请号 201010513719.7的发明专利"一种添加糖化酶发酵制备巧樣酸的方法"公开一种在液化后 接种前，降溫至40~60°C添加糖化酶的工艺，其缺点是加酶溫度太高，大部分糖化酶失活， 导致糖化酶利用率低；申请号201110162278.5的发明专利"一种发酵生产巧樣酸的方法"公 开了在接种发酵后，在36~38°C正常控溫过程中添加糖化酶；申请号201210009294.5的发 明专利"一种发酵制备巧樣酸的方法"公开了在巧樣酸发酵菌种接种后的0~8小时内向发酵 培养基中添加糖化酶。
[0006] 上述几种方法基于共同的指导思想即通过添加糖化酶在发酵初期即获得高浓度 的小分子糖（如葡萄糖），但并未解决发酵过程中后期pH显著下降、糖化酶活力损失而引起 葡萄糖供应与菌株耗糖速率不协调、巧樣酸合成速率放缓、发酵周期偏长、残糖量偏高等问 题。同时带来新的问题:发酵初期培养基本身存在葡萄糖，自身分泌的糖化酶已能够满足发 酵菌株对营养的需求，过高浓度葡萄糖反而会抑制菌种的生长，延长发酵延滞期，不利于巧 樣酸的快速合成。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种基于抑响应阶段添加糖化酶发酵生产巧樣酸的方法， 该方法能解决巧樣酸发酵中后期糖化酶活力损失的问题，有效缩短发酵周期，提高发酵转 化率，降低终发酵液残糖量。
[000引为了达到W上目的，本发明采用W下技术方案： 一种基于pH响应阶段添加糖化酶发酵生产巧樣酸的方法，包括将淀粉质原料进行调 浆、液化、接种发酵，制得终发酵液，还包括在发酵培养过程中，当发酵液抑降至2. ο~3. ο时， 向其中分阶段等量添加糖化酶的步骤。
[0009] 具体地，所述分阶段等量添加为每间隔2~8 h等量添加。
[0010] 具体地，所述糖化酶的添加总量是基于所述发酵液中残余非葡萄糖的含量(残余 总糖与残余葡萄的差值)来确定，添加总量为40~1000 U/g残余非葡萄糖量。
[0011] 具体地，所述淀粉质原料包括玉米粉、小麦粉、木馨粉、红馨粉、淀粉、糖蜜、小麦中 的至少一种。
[0012] 优选地，本发明具体包括W下步骤： (1)将所述淀粉质原料粉末与水按照1:1.5~1:4比例混合均匀，调节抑至5.8~6.0,然 后添加高溫α-淀粉酶，所述淀粉酶添加量为15~50 U/g粉末； (2) 将步骤(2)获得的混合料液经过两次喷射，一次喷射溫度95~105°C，二次喷射溫度 120~130°C，经舰试合格，获得液化混液，再将所述液化混液经过板框过滤获得液化清液； (3) 将步骤（2)获得的液化混液与水混合，加氮源，调节混合液总糖为6~12%，总氮为 0.2%~0.4%，得到种子培养基； (4) 将黑曲霉抱子悬液接种步骤(3)中的种子培养基进行培养，得到成熟种子液； 巧)将步骤(2)获得的液化混液、液化清液与水混合，调节混合液的总糖为16~18%，总氮 为0.05~0.15%，得到发酵培养基； (6) 将步骤(4)获得的成熟种子液接种至步骤巧)获得的发酵培养基中，培养20~32 h; (7) 当上述发酵培养基发酵液抑降至2.0~3.0时，每间隔2~8 h向其中等量添加糖化酶， 添加总量为40~1000 U/g残余非葡萄糖量。
[0013] 如无特殊说明，W上所述百分数均为重量百分数(wt%)。
[0014] 本发明具有如下有益技术效果： 本发明基于发酵菌株生理特性与巧樣酸合成特点，采用在发酵液P邮華至特定范围内 时，根据残余非葡萄糖量分阶段等量添加糖化酶，协调整个发酵过程中葡萄糖供应与葡萄 糖消耗之间达到平衡最优化。一方面既能实现自身糖化酶的高效利用，确保发酵前期菌种 的快速生长;另一方面适时适量添加糖化酶又能有效补偿自身活力的损失，协同巧樣酸发 酵过程，确保在发酵中后期巧樣酸的快速积累，同时能够抵消自身分泌的葡萄糖糖巧酶活 性，减少非发酵糖的产生。应用结果表明，本发明可缩短发酵周期，提高发酵转化率，降低终 发酵液残糖量，降低废水排放，减少废水CODa，具有重要的经济效益和环境效益。
【具体实施方式】
[0015] W下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0016] W下实施例及对比例中，总糖、还原糖的测定方法采用菲林滴定法，巧樣酸的测定 采用浓度0.1429mol/L的化0H滴定，抱子计数采用血球计数板;如无特殊说明，均采用本领 域常用设备和工艺方法。
[0017] 所用原料和试剂如无特殊说明均为市售通用产品。
[001引实施例1 将玉米粉与水按照1:1.5比例混合均匀，调节抑至5.8，然后添加高溫α-淀粉酶，添加量 为50 U/g玉米粉;二次喷射液化，其中一喷溫度为105°C，二次喷射溫度130°C，经舰试合格， 得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液;液化混液与水混合均匀，添加一 定量的硫酸锭配制种子培养基(总糖6%，总氮0.25%)，将成熟的黑曲霉抱子悬液接种种子培 养基，培养8 h时，提高揽拌转速至800 rpm，共培养27 h，获得成熟种子液;将液化混液，液 化清液与水混合配制发酵培养基(总糖16%，总氮0.05%);将成熟种子液接种发酵培养基进 行发酵培养;当发酵液抑降至3.00时添加糖化酶，添加总量为40 U/g残余非葡萄糖量，每间 隔4 h等量添加糖化酶3840 U，当还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期52 h，巧 樣酸含量16.1%，残糖1.2%。
[0019] 实施例2 将玉米粉与水按照1:4比例混合均匀，调节抑至6.0，然后添加高溫α-淀粉酶，添加量 为15 U/g玉米粉;二次喷射液化，其中一喷溫度为95°C，二次喷射溫度120°C，经舰试合格， 得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液;液化混液与水混合均匀，添加一 定量的硫酸锭配制种子培养基(总糖10%，总氮0.30%)，将成熟的黑曲霉抱子悬液接种种子 培养基，培养26 h，获得成熟种子液;将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基(总糖 16.8%，总氮0.08%);将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液抑降至2.52时 添加糖化酶，添加总量为100 U/g残余非葡萄糖量，每间隔4 h等量添加糖化酶16000 U，当 还原糖浓度低于0.5%时结束发酵。测得发酵周期53 h，巧樣酸含量16.9%，残糖0.9%。
[0020] 实施例3 将木馨粉与水按照1:2.5比例混合均匀，调节抑至5.9,然后添加高溫α-淀粉酶，添加 量为25 U/g木馨粉;二次喷射液化，其中一喷溫度为100°C，二次喷射溫度125°C，经舰试合 格，得到液化混液，部分液化混液经过板框过滤得到液化清液;液化混液与水混合均匀，添 加一定量的硫酸锭配制种子培养基（总糖12%，总氮0.40%)，将成熟的黑曲霉抱子悬液接种 种子培养基，培养30 h，获得成熟种子液;将液化混液，液化清液与水混合配制发酵培养基 (总糖16.7%，总氮0.12%);将成熟种子液接种发酵培养基进行发酵培养；当发酵液P啡華至 2.00时添加糖化酶，添加总量为300 U/g残余非葡萄糖量，每间隔8 h等量添加糖化